应用percoll密度梯度离心分离不同类型的花粉粒

密度梯度离心方法是纯化生物大分子、分 离细胞和细胞亚结构（核、叶绿体、线粒体）以及 病毒的一种有用技术,在细胞生物学和分子生 物学的研究中,它起了很重要的作用。曾经使 用过的密度梯度离心介质〔如蔗糖、血清白蛋 白、Ficoll（聚蔗糖）等I,都不是理想的介质。近 年来新发展的梯度禽心介质— percoll是目前 理想的介质。它具有渗透性低、不穿透细胞、粘 度低、密度高和无毒害等优点。     

Percoll等密度梯度离心法分离利什曼原虫细胞核

分离纯化锥虫类原生动物细胞核存在着许多困难,阻碍了人们对这类单细胞生物的细胞核在各方面作进一步研究。本文提出一个从破碎细胞开始的分离核的完整程序。采用起始密度为1.083的Percoll工作液作等密度梯度离心,获得了纯度较高的利什曼原虫(Leishmania gerbilli)细胞核。经测定,L.gerbilli细胞核在Percoll中的浮力密度为1.048—1.051。     

生物大分子和亚细胞结构的分离

分离和纯化生物大分子及亚细胞结构是细胞生物学和生物技术学的基本研究手段之一。由于亚细胞方法学(Subcellular methodology)的建立和从分子水平及亚细胞水平去探索生命现象,使关于细胞结构与功能的研究更加紧密地结合起来了。不仅如此,在深入认识生物信息传递的基础上,采用分子生物学技术和亚细胞分部(Subcellular fraction)的方法,发展了生物工程或生物技术学,使生物学进入一个崭新的阶段。这就使     

酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒的纯化和鉴定及其透射电镜观察

乙肝核心抗原(HBcAg)蛋白基因(C基因)在酿酒酵母中表达,表达产物经过分离和Sepharose CL-4B柱子的初步纯化。产物经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为一分子量约21.5kDa的多肽。再经蔗糖密度梯度超离心和CsCl等密度梯度超离心等过程而被纯化。分管收集的超离心纯化产物经ELISA抗原活性检测和密度分析,可知ELISA反应强度较高的收集管中的颗粒密度主要分布在1.27g/mL和1.40 g/mL两个峰值处。将rHBcAg抗原活性最高的收集管合并,再经TEM观察,发现酵母表达的rHBcAg蛋白(核心蛋白)能自主装配成大小不同的两种核心颗粒,大颗粒直径约为30.1±2.4 nm,小颗粒直径约为21.5±3.3 nm。这表明,酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒具有大小不同的二态性,其生物学意义还未明了,需进一步研究和探讨。     

酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒的纯化和鉴定及其透射电镜观察

乙肝核心抗原(HBcAg)蛋白基因(C基因)在酿酒酵母中表达,表达产物经过分离和Sepharose CL-4B柱子的初步纯化.产物经SDS-PAGE和Western blotting鉴定为一分子量约21.5kDa的多肽.再经蔗糖密度梯度超离心和CsCl等密度梯度超离心等过程而被纯化.分管收集的超离心纯化产物经ELISA抗原活性检测和密度分析,可知ELISA反应强度较高的收集管中的颗粒密度主要分布在1.27g/mL和1.40 g/mL两个峰值处.将rHBcAg抗原活性最高的收集管合并,再经TEM观察,发现酵母表达的rHBcAg蛋白(核心蛋白)能自主装配成大小不同的两种核心颗粒,大颗粒直径约为30.1±2.4 nm,小颗粒直径约为21.5±3.3 nm.这表明,酿酒酵母表达的rHBcAg颗粒具有大小不同的二态性,其生物学意义还未明了,需进一步研究和探讨.     

生物大分子分离纯化技术的重大突破──灌注层析系统

生物大分子分离纯化技术的重大突破──灌注层析系统夏小燕（北京化工学院）傅仲华（中国科学院发育生物研究所）现代生物大分子分离纯化技术的发展,促进了生命科学,医学及医药工业的发展,液相色谱仪是生物分子分离纯化的重要工具,而其中分离介质尤为重要。     

超速离心技术

超速离心是生物学研究中的一项重要技术,用于细胞、亚细胞组分和生物大分子(如蛋白质、核酸等)的分离与分析。习惯上把每分钟4,000转的离心机称为低速离心机;每分钟20,000转的离心机称为高速离心     

酵母亚细胞结构分离效率评估菌株的构建 *

背景: 真核细胞依赖其亚细胞结构高效地完成复杂的生化反应。尽管目前有一些亚细胞结构分离技术,但却缺乏评估这些分离技术的简单、有效方法。目的: 构建可以用来检测亚细胞结构分离效率的酿酒酵母菌株。方法: 通过传统的分子生物学与细胞生物学方法以酿酒酵母为背景构建了亚细胞结构分离效率评估菌株,并进行可行性检测。首先,将酵母各细胞器、自噬体及质膜的标记蛋白进行分组,用不同的蛋白标签分别标记每组蛋白。然后,以标记蛋白-GFP/RFP作为对照组通过免疫荧光法检测蛋白标签对标记蛋白的亚细胞定位是否有影响。最后,通过非连续性密度梯度离心验证该检测菌株能否用来检测亚细胞结构的分离效率。结果: 成功构建了酵母亚细胞结构分离效率评估菌株,该菌株标记了大多数酵母细胞亚细胞结构。挂标签的标记蛋白仍然定位在各自标记蛋白对应的亚细胞结构。非连续性密度梯度离心后,酵母各个亚细胞结构的标记蛋白均可以被检测到。结论: 该酵母亚细胞结构分离效率评估菌株是检测各亚细胞结构分离结果的方便工具,对今后酿酒酵母细胞生物学的研究有潜在的应用价值。     

应用免疫技术纯化特异性mRNA

真核基因表达的调控的研究,是分子生物学最活跃的领域之一。为了深入地对这一问题进行研究,分离特定蛋白质的信使RNA(mRNA)及其基因(DNA)是非常之必需。由于mRNA分子的长度随其所编码的多肽链的长度不同而有很大的差别,因此按其分子量的大小和密度,通过密度梯度超离心的方法,从理论上来说可以得到不同的mRNA。然而到目前为止,用此法只从特定组织或细胞中分离纯化几种蛋白质的mRNA,如分别从网织红血球、蚕丝腺以及早期海胆胚及同步的Hela细胞中分离纯化了血红蛋白、丝蛋白及组蛋白等mRNA,由于这些mRNA多半是这些组织和细胞中mRNA     

纤维素微球色谱介质制备、孔结构调控及聚合物改性

作为色谱技术的核心,高效色谱介质的研制与开发是提高生物大分子纯化效率的重要手段之一.纤维素微球是最早应用于生物分离的色谱介质之一.这主要是因为纤维素的基本结构为多糖化合物,表面含有大量羟基,易于修饰功能配基,且非特异性吸附弱,特别适合不稳定生物大分子的分离纯化.本文综述了纤维素微球色谱介质的研究新进展.首先简要介绍了纤...     

实验室常用离心技术与应用

离心机是生物学教学、科研领域中常见的仪器,离心技术也是分离、制备、纯化生物样品的重要手段。沉淀离心法、差速离心法、密度梯度离心法是实验室常用的3种离心技术,对其工作原理及应用范围做出简单的分析和比较。     

超离心法及其在放射损伤研究中的应用

超离心机是研究高分子化合物如生物大分子蛋白质、核酸和病毒等的一个重要工具。在分析方面主要用以测定这些生物大分子的沉降系数与分子量。在制备方面可用以分离这些生物大分子和有关的亚细胞成分。在研究电离辐射对细胞原发损伤的规律时,观察射线对生物大分子的损伤和亚细胞成分的破坏,及其对生化功能的影响等问题,超离     

我国生物制造分离过程技术与装备研究进展

<正>生物产物的分离与纯化是生物制造过程的重要单元,关系生化产品的质量与制造成本。大多数生化产品需要综合利用多个分离纯化技术才能确保终端产品质量达标。近年来,我国在相关介质、技术和装备的研究与应用方面取得了长足进步。文章针对生物大分子蛋白、生物乙醇和丁醇、发酵调味品、1,3-丙二醇、呈味核苷酸二钠等典型生物发酵产品的分离纯化。重点介绍了我国近年     

大鼠海马细胞质膜的分离及其蛋白质组学分析

运用差速离心和连续蔗糖密度梯度离心的方法分离纯化成年大鼠海马组织细胞质膜并用Western blotting对质膜样品进行检测.结果表明,在蔗糖密度梯度离心介质中,膜片主要集中于蔗糖浓度为32%~42%的区段(密度约1.13~1.18),其次是20%~25% (密度约1.08~1.10)的区段.39%(密度约1.17)层面上质膜浓度和纯度最高.一维SDS-PAGE分离和CapLC-MS/MS分析后,通过数据库搜寻从大鼠海马组织细胞质膜样品中共鉴定出135种蛋白质, 其中质膜蛋白和与膜相关的蛋白质共70种(占51.9%), 主要包括Na⁺/K⁺-ATPase、Glutamate/aspartate transporter、Lipophilin、GLAST 1a等. 为研究海马组织细胞的功能和大鼠海马组织细胞质膜蛋白质数据库的建立积累了有价值的资料.     

大豆黄化子叶、幼芽完整质体和线粒体的分离纯化及其标记酶分析

采用分部离心及蔗糖密度梯度离心相结合的方法分离纯化大豆子叶和幼芽完整质体和线粒体,并以质体标记酶——磷酸三碳糖异构化酶和线粒体标记酶——细胞色素C氧化酶,分析蔗糖密度梯度离心后质体和线粒体的分布和纯度,用电子显微镜检查分离质体和线粒体的完整性。结果指出大豆子叶和幼芽的质体,线粒体分别分布在蔗糖密度梯度1.22g/cm~3和1.18g/cm~3区,分离的质体和线粒体纯度都在95％以上,完整性也是令人满意的。     

一种新的纯化玉米粗缩病毒的方法及病毒形态的研究

玉米粗缩病毒是一种双链RNA病毒,结构比较复杂。病毒粒子极不稳定,在分离纯化过程中,外层蛋白衣壳易脱落,成为亚病毒颗粒,纯化的病毒粒子在冰箱中存放2～3天,也会变成亚病毒颗粒,所以迄今为止,所有玉米粗缩病毒的研究或纯化均用感病植株的根部作材料,以达到减少膜结构等杂质影响,简化提纯步骤的目的。但病株根部收获量少,而且病毒含量不高。我们采用四氯化碳,葡聚糖凝胶2B柱分离以及25～50%的蔗糖密度梯度离心等技术成功地从感病小麦的叶片中分离提纯了玉米粗缩病毒。电镜观察结果证明,经蔗糖密度梯度离心后出现的两条病毒带,上带含有大量直径为60～66nm的亚病毒粒子的空壳,下带含有大量的完整病毒粒子及亚病毒粒子,完整病毒粒子的大小在未暴露A突起的情况下直径约85nm,带有A突起的为75nm,亚病毒粒子带有不完整的B突起,直径约60nm,这些数字均比国外报道的玉米粗缩病毒略大。我们还发现一些直径为45nm左右的亚病毒粒子空壳,从而进一步证明我们以前的工作,认为玉米粗缩病毒可能存在三层甚至四层蛋白外壳。     

三株柯萨奇A10型候选疫苗株生物学特性及免疫原性研究

近年来CV-A10已成为手足口病的最主要的病原体之一。本研究对3株不同CV-A10毒株进行生物学特性及体液免疫原性比较分析，筛选最适的CV-A10灭活疫苗候选株。将2014年荆州（JZ）分离株CV-A10-L12、2019江苏沛县（PX）分离株CV-A10-195和CV-A10-300，作为候选疫苗株经10层Vero细胞工厂培养，蔗糖垫底离心、蔗糖梯度离心、氯化铯等密度梯度离心后收获病毒颗粒。对不同候选毒株的滴度、病毒实心颗粒（FP）和空心颗粒（EP）的产量和比例、氯化铯密度、形态及结构蛋白等生物学特性进行比较分析。将纯化后病毒颗粒经甲醛灭活后，免疫Balb/C小鼠评价免疫原性。三株CV-A10候选疫苗株细胞工厂培养、纯化后，收获了高纯度、含病毒结构蛋白、形态完整的EP、FP颗粒。按照细胞培养自然EP和FP比例混合后，免疫6周龄Balb/C小鼠。以同源和非同源的四株CV-A10毒株作为中和毒种，测血清中和抗体滴度，评价3个疫苗候选株的体液免疫原性。CV-A10-195/PX/2019株病毒颗粒产量及免疫原性高于CV-A10-300/PX/2019株，高于CV-A10-L12/JZ/20...     

Optiprep连续密度梯度离心方法的建立

目的:试验不同条件,优化Optiprep密度梯度离心方法,建立最佳的Optiprep连续密度梯度,为纯化病毒提供良好的参数。方法:试验不同的旋转角度、重复次数、离心时间,以及用不同浓度的Optiprep制备连续密度梯度等条件,摸索制备连续密度梯度的最佳方案,将此最佳方案应用于纯化丙肝病毒(HCV),并通过q RT-PCR验证纯化效果。结果:通过各种条件的摸索,确立了制备连续密度梯度的最佳方案,即制备10%~40%Optiprep连续密度梯度,在旋转角度为85°时,1号程序设置为30 r/min离心5 s,2号程序设置为0 r/min 15 s,重复1~2程序10次。将此程序用于纯化HCV,得到了较好的纯化效果。结论:建立了制备Optiprep连续密度梯度离心的方法,为进一步提高病毒的纯化效果提供了参数。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。SFTS新布尼亚病毒全基因组已解析,但病毒分子生物学结构蛋白特征及功能尚需更多研究。本文通过蔗糖密度梯度离心确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(HB29株)病毒颗粒的沉降密度及超离纯化条件,得出该病毒颗粒在蔗糖中的沉降密度为1.135g/mL。利用PCR方法扩增SFTSV病毒株HB29株病毒RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体蛋白(M)、包膜糖蛋白(Gn)、包膜糖蛋白(Gc)、核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)的编码区基因片段,分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT或VR1012,在293T细胞上获得上述基因表达。通过SDS-PAGE分析纯化病毒颗粒和重组蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光(IFA)确定蛋白活性和分子量。本研究结果将有利于对新布尼亚病毒分子生物学特征的认识,为后期研究提供基础。     

间臂和丁基密度对疏水层析分离纯化重组乙肝病毒表面抗原的影响

以国产高交联度的快流速琼脂糖为基质,合成了针对纯化中国仓鼠卵巢细胞表达乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的不同间臂(3C、8C和10C)和不同配基密度的丁基疏水介质。配基密度的增加和间臂C链的延长都会增加介质的疏水性,从而影响其对CHO-HBsAg的分离效果。采用正交实验考察了配基密度、盐浓度、pH值三个影响因素对不同间臂疏水介质性能的影响。以分离CHO表达的乙肝病毒表面抗原(CHO-HBsAg)的收率和纯化倍数为主要指标。根据正交试验结果,分离效果最佳的介质间臂为8C、配基密度为22μmol/mL。该介质在硫酸铵浓度9%、pH7.0条件下,CHO-HBsAg的收率可以接近100%,纯化倍数达到60。