MicroRNA-411a-3p过表达抑制Ca2+信号转导与羊驼黑色素细胞的增殖和迁移

黑色素细胞中产生的黑色素转移及黑色素细胞的增殖和迁移均与色素沉积有关。黑色素细胞的增殖需要有丝分裂原协同进行。黑色素细胞的增殖和分化受组织环境以及多种毛色基因的调控。miRNA-411a-3p在不同毛色羊驼皮肤中呈差异表达,且通过靶向IGF1R调控黑色素生成。但miRNA-411a-3p是否与黑色素颗粒迁移、黑色素细胞的增殖和迁移相关未见报道。本研究通过miRNA-411a-3p转染羊驼黑色素细胞后发现,与对照组相比,钙离子信号转导水平下降了（91.73±1.53）% (P<0.01),与黑色素转移有关的Rab27a和肌球蛋白Va在蛋白质水平的表达均被下调,同时与细胞增殖有关的整联蛋白β1和β5相关基因在转录水平分别下降了（44.67 ± 13.67）%（P<0.01）和（30.72 ± 6.23）% (P<0.01),在蛋白质水平表达下降了（45.18 ± 1.96）% (P<0.001)和（11.52 ± 1.09）% (P<0.001)。综上所述,miRNA-411a-3p过表达后会抑制钙离子信号转导,以及羊驼黑色素细胞的增殖和迁移。     

MicroRNA-411a-3p过表达抑制Ca2+信号转导与羊驼黑色素细胞的增殖和迁移

黑色素细胞中产生的黑色素转移及黑色素细胞的增殖和迁移均与色素沉积有关。黑色素细胞的增殖需要有丝分裂原协同进行。黑色素细胞的增殖和分化受组织环境以及多种毛色基因的调控。miRNA-411a-3p在不同毛色羊驼皮肤中呈差异表达,且通过靶向IGF1R调控黑色素生成。但miRNA-411a-3p是否与黑色素颗粒迁移、黑色素细胞的增殖和迁移相关未见报道。本研究通过miRNA-411a-3p转染羊驼黑色素细胞后发现,与对照组相比,钙离子信号转导水平下降了（91.73±1.53）% (P<0.01),与黑色素转移有关的Rab27a和肌球蛋白Va在蛋白质水平的表达均被下调,同时与细胞增殖有关的整联蛋白β1和β5相关基因在转录水平分别下降了（44.67 ± 13.67）%（P<0.01）和（30.72 ± 6.23）% (P<0.01),在蛋白质水平表达下降了（45.18 ± 1.96）% (P<0.001)和（11.52 ± 1.09）% (P<0.001)。综上所述,miRNA-411a-3p过表达后会抑制钙离子信号转导,以及羊驼黑色素细胞的增殖和迁移。     

MicroRNA-411a-3p靶向钙/钙调素依赖蛋白激酶4调控羊驼黑色素细胞中的黑色素生成（英文）

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色。毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的。然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA和lncRNA调控。但是,miR-411a-3p对羊驼色素形成起调控作用未见报道。为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究。经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4, CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降(34.78±16.09)%(P0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一。miR-411a-3p通过结合CaMK4的3′untranslated region (3′-UTR)直接调控CaMK4的表达。在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著(53.66±2.11)%(P0.01)。Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为(70.26±4.84)%(P0.01)和(70.11±9.05)%(P0.01)。Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒。通过紫外分光度法检测真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(phenomelanin,PM)显示,EM和PM的含量均被下调。结果表明,miR-411a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义。     

MicroRNA-411a-3p靶向钙/钙调素依赖蛋白激酶4调控羊驼黑色素细胞中的黑色素生成

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色。毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的。然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA 和lncRNA调控。但是,miR-411a-3p 对羊驼色素形成起调控作用未见报道。为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究。经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4, CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降（34.78 ± 16.09）%(P<0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一。miR-411a-3p通过结合CaMK4的3′ untranslated region (3′-UTR)直接调控CaMK4的表达。在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著（53.66 ± 2.11）%（P<0.01）。Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为（70.26 ± 4.84）%（P<0.01）和（70.11 ±9.05）%（P<0.01）。Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒。通过紫外分光度法检测真黑素（eumelanin,EM）和褐黑素（phenomelanin,PM）显示,EM和PM的含量均被下调。结果表明,miR-411a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义。     

MicroRNA-411a-3p靶向钙/钙调素依赖蛋白激酶4调控羊驼黑色素细胞中的黑色素生成

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色。毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的。然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA 和lncRNA调控。但是,miR-411a-3p 对羊驼色素形成起调控作用未见报道。为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究。经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4, CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一。双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降（34.78 ± 16.09）%(P<0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一。miR-411a-3p通过结合CaMK4的3′ untranslated region (3′-UTR)直接调控CaMK4的表达。在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著（53.66 ± 2.11）%（P<0.01）。Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为（70.26 ± 4.84）%（P<0.01）和（70.11 ±9.05）%（P<0.01）。Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒。通过紫外分光度法检测真黑素（eumelanin,EM）和褐黑素（phenomelanin,PM）显示,EM和PM的含量均被下调。结果表明,miR-411a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义。     

miR-411a-3p抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成

microRNA-411a-3p（miR-411a-3p）在不同毛色羊驼皮肤中差异表达,提示其可能在毛色形成中起调控作用。为证明miR-411a-3p在羊驼皮毛黑色素形成中的作用,本研究通过生物信息学预测及靶基因搜索,发现胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）是miR-411a-3p的靶基因,继而构建了含Igf1r mRNA 3′-UTR的荧光素酶报告基因载体。报告基因转染结合报告酶活性测定证明,Igf1r是miR-411a-3p的靶基因。原位杂交显示,miR-411a-3p主要在羊驼黑色素细胞胞质中表达,提示其可能在黑色素细胞中具有重要作用。qRT-PCR揭示,棕色和黑色羊驼皮肤中miR-411a-3p表达量明显低于白色羊驼。qRT-PCR联合蛋白质印迹分析显示,在羊驼黑色素细胞过表达miR-411a-3p,伴随Igf1r下调,小眼畸形相关转录因子（Mitf）依赖的毛色基因酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸酶相关蛋白-2（Tyrp2）及黑色素表达水平明显下调。上述结果提示,miR-411a-3p可通过靶向抑制Igf1r负调控羊驼黑色素黑色素合成。该结果将加深我们对羊驼毛色形成机制的认识。     

miRNA-338-3p通过靶向抑制MC1R基因表达抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成

黑色素皮质素1受体MC1R）是在黑色素细胞内表达的G蛋白耦合受体（G protein coupled receptor, GPCR）家族成员,参与黑色素细胞中黑色素的生成。微RNAs（miRNAs）是一类非编码RNA,通过与靶基因3′-UTR结合抑制基因表达。已有研究证明,miR-338-3p 在多种人类肿瘤细胞中（过）表达,可通过下调靶基因表达抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。然而,有关miR-338-3p对羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素合成影响却罕见报道。本研究证明,miRNA-338-3p通过靶向抑制MC1R基因表达,抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成。采用生物信息学预测MC1R基因是miRNA-338-3p的靶基因,其基因表达抑制羊驼黑色素细胞黑色素合成。随后构建miR-338-3p真核表达载体。其基因转染结合qPT-PCR和Western印迹结果揭示,与对照细胞比较,过表达miRNA-338-3p的羊驼黑色素细胞的MC1R基因,及其下游与黑色素生成相关的小眼相关性转录因子（MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）、酪氨酸酶相关蛋白2（TYRP2）编码基因mRNA及蛋白质表达水平明显下调。酶联免疫吸附分析显示,过表达miRNA-338-3p的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素产量,较对照细胞显著下降（P＜0.01）。综上结果,miR-338-3p可通过抑制靶基因MC1R表达,下调其下游基因MITF、TYR、TYRP1和TYRP2基因的表达,从而抑制羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的合成。miRNA-338-3p在羊驼生长发育过程中,是否参与调控体内皮肤黑色素细胞的黑色素生成尚待进一步研究。     

FLT4 调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

血管内皮素生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR-3/FLT4）与黑色素瘤细胞的生长有关,其可能对毛色及黑色素生成有一定的调控作用。为探讨FLT4基因对羊驼毛色及黑色素生成的影响,本文采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western印迹对FLT4在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的表达进行了研究。结果显示,FLT4在不同毛色毛囊中外根鞘及毛乳头阳性表达不同,且棕色皮肤比白色皮肤阳性信号强;FLT4 mRNA在棕色羊驼皮肤的表达量明显高于白色羊驼皮肤 (P<0.01);FLT4蛋白在棕色皮肤中的表达量明显高于白色皮肤(P<0.01);为进一步研究FLT4对黑色素生成的影响;通过对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度的FLT4蛋白（0, 1, 10, 50, 100 ng/mL）,与对照组相比,添加FLT4蛋白后酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白-1(TYRP1)、受体酪氨酸激酶 c-KIT、小眼畸形相关转录因子(MITF)的 mRNA和蛋白质表达明显增加, 10 ng/mL组表达量最高(P<0.01);黑色素含量测定结果表明,不同浓度的FLT4蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素含量比对照组明显升高,添加FLT4蛋白10 ng/mL表达量最高(P<0.01)。由此可知,FLT4可以通过调节毛色相关基因的表达进而引起黑色素细胞中黑色素含量的变化。     

lpa-miR-nov-66通过调控cAMP路径抑制α-MSH介导的羊驼黑色素生成

α-黑素细胞刺激素(α-MSH)和lpa-miR-nov-66在羊驼黑色素细胞产生黑色素过程中均起重要的调控作用,但二者之间的关系尚未报道.本研究在体外培养的羊驼黑色素细胞中通过转染lpamiR-nov-66和添加α-MSH处理,用实时定量PCR和Western印迹检测黑色素细胞内基因表达水平,ELISA法检测c AMP和cGMP的产量,RTCA实时无标记细胞功能分析黑色素细胞增殖以及紫外分光光度法检测黑色素产量,证实二者在调控羊驼黑色素细胞产生黑色素颗粒过程中的关系.结果显示,与单纯α-MSH处理相比,lpa-miR-nov-66转染结合α-MSH处理组中,小眼转录因子(MITF)和酪氨酸酶(TYR)在转录水平和翻译水平的表达均降低,而酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)在转录和翻译水平的表达均升高;cGMP的产量升高,cAMP的产量下降;黑色素细胞增殖没有显著变化;黑色素细胞内黑色素产量下降.与单纯转染lpa-miR-nov-66相比,lpa-miR-nov-66转染结合α-MSH处理组中,MITF、TYR和TYRP2在转录水平和翻译水平的表达均升高;cGMP的产量下降,cAMP的产量升高;黑色素细胞增殖没有显著变化;黑色素细胞内黑色素产量升高.上述结果证明,lpa-miR-nov-66通过调控羊驼黑色素细胞中毛色形成的c AMP路径,抑制α-MSH对黑色素细胞产生黑色素的促进作用.     

miR-380调控羊驼黑色素细胞MAPK/ERK信号通路

miR-380是不同羊驼毛色中差异表达的基因之一,但是否与黑色素生成有关未见报道。为了丰富调控黑色素生成的机制,挖掘黑色素生成路径中所涉及到的更多新的基因并揭示miR 380在黑色素细胞中的功能,本实验通过生物信息学方法预测出MAPK信号通路的成员MAP3K6是miR-380的靶基因之一。在293T细胞中共转染miR-380和MAP3K6后,与对照组相比双荧光报告酶活性下降（28.92 ± 25.63）%(P<0.01) ,下降趋势明显,说明MAP3K6可能是miR-380的靶基因之一;在羊驼黑色素细胞中转染miR-380后,MAP3K6、MEK1、ERK1/2、CREB和MITF在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中CREB下降趋势尤为显著（64.20 ± 54.30）%（P<0.01）,Western印迹检测MAP3K6、p-MEK1、p-ERK1/2、CREB和MITF在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显且p-MEK1和CREB基因下降极为显著,分别为（29.09 ± 10.68）%（P<0.001）和（47.12 ± 6.70）%（P<0.001）,抑制组则反之。通过 Masson-Fontana黑色素颗粒染色法检测miR-380抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒,用紫外分光度法检测真黑素（eumelanin,EM）和褐黑素（pheomelanin,PM）,含量结果提示EM与PM含量分别下降为（38.63 ± 2.00）%（P<0.01）,（54.10 ± 5.73）%（P<0.001）且PM含量下降极为显著。综上所述miR-380通过靶向抑制MAP3K6等基因的表达,从而对MAPK/ERK信号通路起调控作用,最终影响黑色素生成生物学功能,此研究对哺乳动物毛色形成机制和防止皮肤受紫外辐射有重要意义。     

人KRT2促进体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素生成

基因表达谱显示,绵羊角蛋白2（keratin2, Krt2）的mRNA在不同毛色皮肤的表达不同,暗示Krt2 基因可能对皮肤黑色素生成有一定的影响。为探索角蛋白2对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞黑色素生成的影响,首先采用PCR扩增产物测序,结合DNAMAN 软件比对分析发现,羊驼Krt2 编码序列（cDNA）与NCBI公布的人KRT2高度同源（91%）;将人KRT2添加于培养的羊驼皮肤黑色素细胞,观察人KRT2对羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的生成作用。免疫组织化学显示,外源性的人KRT2处理羊驼皮肤黑色素细胞72 h后,黑色素细胞的细胞质中Krt2表达增强。实时定量PCR及Western 印迹实验揭示,与胎牛血清清蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞比较,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸相关蛋白-1（Tyrp1）、小眼畸形相关转录因子（Mitf）基因表达明显上调（P <0.05）;尤其在添加10 ng/mL KTR2的细胞中,3个基因的mRNA相对表达水平升高尤其显著,分别是对照细胞的4倍、10倍和12.9倍（P<0.01）,蛋白质相对表达水平分别是对照细胞的2倍、2.1倍和1.7倍（P<0.01）。分光光度法测量A490结果证明,1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞产生的黑色素含量分别是对照细胞的1.3倍（P <0.05）、1.8倍（P <0.01）和1.5倍（P <0.05）。上述结果说明,人KTR2处理可通过刺激羊驼皮肤黑色素细胞黑色素合成相关信号通路,促进黑色素的合成。     

人KRT2促进体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素生成北大核心CSCD

基因表达谱显示,绵羊角蛋白2(keratin2,Krt2)的mRNA在不同毛色皮肤的表达不同,暗示Krt2基因可能对皮肤黑色素生成有一定的影响。为探索角蛋白2对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞黑色素生成的影响,首先采用PCR扩增产物测序,结合DNAMAN软件比对分析发现,羊驼Krt2编码序列(c DNA)与NCBI公布的人KRT2高度同源(91%);将人KRT2添加于培养的羊驼皮肤黑色素细胞,观察人KRT2对羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的生成作用。免疫组织化学显示,外源性的人KRT2处理羊驼皮肤黑色素细胞72 h后,黑色素细胞的细胞质中Krt2表达增强。实时定量PCR及Western印迹实验揭示,与胎牛血清清蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞比较,1 ng/m L、10 ng/m L和100 ng/m L人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸相关蛋白-1(Tyrp1)、小眼畸形相关转录因子(Mitf)基因表达明显上调(P<0.05);尤其在添加10 ng/m L KTR2的细胞中,3个基因的mRNA相对表达水平升高尤其显著,分别是对照细胞的4倍、10倍和12.9倍(P<0.01),蛋白质相对表达水平分别是对照细胞的2倍、2.1倍和1.7倍(P<0.01)。分光光度法测量A490结果证明,1 ng/m L、10 ng/m L和100 ng/m L人KTR2处理的羊驼皮肤黑色素细胞产生的黑色素含量分别是对照细胞的1.3倍(P<0.05)、1.8倍(P<0.01)和1.5倍(P<0.05)。上述结果说明,人KTR2处理可通过刺激羊驼皮肤黑色素细胞黑色素合成相关信号通路,促进黑色素的合成。     

MiR-199a-5p对肝星状细胞活化增殖的影响

miR-199a-5p是miRNAs家族的一员.为探讨对人肝星状细胞活化增殖和迁移的影响,为临床肝纤维化治疗提供新的思路,本研究构建miR-199a-5p过表达载体、合成miR-199a-5p反义寡聚核苷酸(anti-sense oligonucleotide,ASO)经脂质体转染LX-2细胞.采用CCK-8法和Transwell分别检测细胞增殖和迁移能力;集落形成实验检测LX-2细胞的集落形成能力;实时荧光定量PCR技术检测细胞中转染miR-199a-5p后纤维化相关基因α-SMA和Collagen Ⅰ的mRNA表达水平;Western blot检测各组细胞中α-SMA表达水平.结果 表明miR-199a-5p可以促进LX-2细胞增殖(P＜0.01)、迁移(P＜0.01)和集落形成(P＜0.01);而ASO-199a-5p-5p组细胞增殖(P＜0.01)、迁移能力(P＜0.01)和集落形成能力(P＜0.01)受到抑制.RT-qPCR结果显示miR-199a-5p在受TGF-β1刺激后的LX-2细胞中的miRNA表达水平高于未受刺激组的(P＜0.05),转染miR-199a组细胞中α-SMA的mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.05)表达水平升高.以上结论表明miR-199a-5p过表达能促进肝星状细胞活化、增殖.     

Lpa-miR-nov-66拮抗IGF1促羊驼黑色素细胞黑色素生成及细胞迁移作用

胰岛素样生长因子1（IGF1）能够促进细胞迁移。我们最近的研究发现,一种新发现的miRNA（lpa-miR-nov-66）可通过靶向抑制可溶性腺苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase,sGC）抑制黑色素细胞产生黑色素。然而,当二者联合作用于黑色素细胞时,究竟如何影响黑色素细胞的黑色素产生及细胞迁移尚未见报道。本研究证明,lpa-miR-nov-66可拮抗IGF1的促黑色素细胞的黑色素生成及促细胞迁移作用。ELISA法检测结果揭示,与单纯IGF1处理比较,过表达lpa-miR-nov-66或过表达lpa-miR-nov-66联合IGF1处理可明显降低IGF1诱导羊驼黑色素细胞的cAMP生成水平。实时定量PCR和Western印迹证明,与单纯IGF1处理比较,过表达lpa-miR-nov-66或联合处理可明显降低毛色生成相关基因--MITF、TYR、和TYRP1在黑色素细胞的表达。此外,细胞增殖和细胞划痕实验显示,与单纯IGF1处理比较,过表达lpa-miR-nov-66或联合处理可显著抑制黑色素细胞的迁移。上述结果表明,lpa-miR-nov-66可以减少cAMP产生,抑制IGF1的促黑色素细胞产生黑色素的作用,并抑制IGF1对黑色素细胞增殖和迁移的促进作用。     

miR-34a-5p通过靶向醛缩酶A抑制肝癌细胞的增殖和迁移

[目的]证明醛缩酶A(ALDOA)在肝癌细胞的增殖和迁移作用并探索miR-34a-5p靶向调控ALDOA的分子机制,为肝癌治疗提供潜在的分子靶标。[方法]分子生物学技术构建了ALDOA表达质粒,蛋白质印迹(Western Blotting)和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测ALDOA的过表达和敲降效果,CCK-8验证细胞的增殖,划痕实验验证细胞的迁移。[结果]在肝癌细胞中过表达ALDOA能促进肝癌细胞的增殖与迁移(P 0.05),敲降ALDOA后肝癌细胞的增殖与迁移受到抑制(P 0.05),miR-34a-5p是通过靶向结合ALDOA的3'UTR抑制其表达从而抑制肝癌细胞的增殖与迁移(P 0.05)。[结论]miR-34a-5p通过靶向ALDOA抑制肝癌细胞的增殖和迁移。     

EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的表达与定位

内皮素3（endothelin 3, EDN3）对早期黑色素细胞的迁移及增殖分化有促进作用,并可通过与其受体结合促进黑色素的合成。EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的差异及其在毛色形成过程中的作用仍有待研究。实时荧光定量PCR结果显示,灰色小鼠皮肤中EDN3的表达量显著高于黑色及棕色小鼠,约为其2倍(P<0.01)。蛋白免疫印迹结果显示,灰色小鼠皮肤内EDN3的含量为黑色小鼠的5倍,棕色小鼠为黑色小鼠的2倍。ELISA结果表明,灰色小鼠皮肤中EDN3的蛋白质表达量分别是黑色和棕色小鼠的1.8倍和1.4倍(P<0.01)。免疫组织化学显示,EDN3在毛囊的毛基质及内外毛根鞘有明显表达,毛乳头等部位有少量表达。EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的表达存在显著差异,是维持黑色素细胞存在不可缺少的因子,可能对两种色素颗粒的相互转化有一定的作用。     

过表达微小RNA-130a-3P对LPS诱导心肌细胞损伤的干预作用及其机制*

目的: 探讨miRNA-130a-3p对脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞自噬与凋亡的影响及分子机制。方法: H9C2心肌细胞随机分为5组,即正常对照组,LPS模型组,miRNA阴性对照组(miRNA-negative control组),miRNA-130a-3p mimics组(过表达miRNA-130a-3p),miRNA-130a-3p mimics+LY294002组(过表达miRNA-130a-3p + PI3K抑制)。LPS模型组即终浓度为10 μg/ml的LPS诱导24 h,miRNA阴性对照组与miRNA-130a-3p mimics组是利用lipo3000将阴性对照miRNA及miRNA-130a-3p mimics转染至H9C2细胞,培养24 h后,再将LPS加入培养基中培养24 h。miRNA-130a-3p mimics + LY294002组是利用lipo3000将miRNA-130a-3p mimics转染至H9C2细胞,同时在培养基中加入10 μmol/L(终浓度)的LY294002,培养24 h后,再将浓度为10 μg/ml的LPS加入培养基中培养24 h。所有实验均重复5次以上。利用RT-qPCR检测细胞中miRNA-130a-3p mRNA的表达水平,利用CCK-8实验检测细胞活性,利用ELISA实验检测细胞培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-1β (IL-1β)的含量,利用比色法检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量;利用Western blot检测细胞中p-PI3K蛋白,p-AKT蛋白,Bax蛋白,Bcl-2蛋白,cleaved-caspase-3蛋白,LC3蛋白,p62蛋白的表达水平。结果: 结果显示,与正常组相比较,LPS模型细胞中miRNA-130a-3p mRNA水平,p-PI3K蛋白与p-AKT蛋白的水平显著低于正常对照组(P<0.01);与LPS组相比较,miRNA-130a-3p mimics组细胞中p-PI3K,p-AKT蛋白的表达显著升高(P<0.01,P<0.05);与正常对照组相比较,LPS组细胞活性显著降低,细胞培养液中TNF-α,IL-6,IL-1β及 LDH的含量显著升高(P<0.01), SOD的含量显著降低(P<0.01),细胞中Bax蛋白,cleaved caspase-3蛋白,p62蛋白的表达显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白的表达和LC3II/I的比率显著降低(P<0.01);与LPS组相比较,miRNA-130a-3p mimics可提高细胞活性,降低细胞培养液中TNF-α,IL-6,IL-1β及LDH的含量(P<0.01,P<0.05),提高SOD的含量(P<0.05),降低细胞中Bax蛋白,cleaved caspase-3蛋白,p62蛋白的表达(P<0.01),促进Bcl-2蛋白的表达(P<0.01),提高LC3II/I的比率(P<0.05);与miRNA-130a-3p mimics组相比较,miRNA-130a-3p mimics+LY294002组,可部分逆转miRNA-130a-3p mimics对细胞的作用。结论: 过表达miRNA-130a-3p可部分通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞的自噬与抑制细胞凋亡,减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。     

羊驼皮肤Scf基因的分子克隆、表达分析及组织学分布（英文）

干细胞因子(SCF)是一种生长因子,在黑素细胞迁移、细胞增殖和分化中发挥重要的调节作用。为了探讨SCF的分子特性及其在不同毛色羊驼皮肤中的表达模式,本研究通过PCR克隆羊驼Scf基因的全长编码区(CDS),并运用生物信息学预测其编码蛋白质特征;采用实时定量PCR (qRT-PCR)、Western印迹和免疫荧光分析SCF的表达模式和组织分布。结果表明,Scf编码区核苷酸为740 bp,编码1个246个氨基酸的前体蛋白质。该蛋白质包含1个跨膜区和1个信号肽,其二级结构核心是4个α-螺旋(αA,αB,αC和αD)和2条反平行的β-折叠链;序列比对和系统发育分析显示,羊驼SCF序列与猪、牛、羊同属于一个分支;棕色羊驼皮肤SCF表达显著高于白色羊驼,SCF蛋白主要位于毛囊基质与毛根鞘中,且Fontana-Masson染色显示,棕色羊驼皮肤中含有更多的黑色素颗粒。以上研究结果证实,在棕色羊驼毛皮肤中SCF的表达量和黑色素含量均高于白色羊驼毛皮肤,且SCF的高级结构与毛色形成密切相关。     

DKK3调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

Dickkopf-3(DKK3),Wnt/p-catenin信号通路中一个重要的抑制因子,可能参与调控黑色素生成过程.本文研究了DKK3在羊驼黑色素细胞中黑色素生成的作用.在羊驼黑色素细胞中,过表达DKK3显著下调Wntl,Lefl,Myc和黑色素生成相关基因MITF及其下游基因TYR,TYRP1和TYRP2的表达,在...