微生物几丁质酶研究进展及应用*

几丁质由N-乙酰-D-氨基葡萄糖聚合而成,是自然界中仅次于纤维素的第二大类聚合物。微生物几丁质酶来源丰富,是生物降解或利用几丁质的主要媒介。野生型菌株几丁质酶产量低、活性弱,故近年来有关几丁质酶的研究侧重于对其产量及催化活性的提升等方面。此外,几丁质酶具有水解病原真菌细胞壁、破坏害虫体壁、生产N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或单体的应用价值,在医药、农业、食品加工等领域表现出巨大的市场潜力。综述微生物几丁质酶的来源、分类及工程改造,为后续几丁质酶的研究及开发利用提供参考。     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA7的表达与结合活性分析

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标。通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(Gen Bank登录号为MG604929),该基因长1 431 bp,包含开放阅读框长1 134 bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156 k D。结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白。分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达。本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据。     

几丁质及其衍生物的应用前景

广泛分布于自然界中唯一含氨基的碱性均态生物同聚多糖——几丁质(Chitin)及其脱乙酰基的产物脱乙酰几丁质(Chitosan)等衍生物是一类能被生物合成和降解,对环境不造成污染,有着极为广阔应用前景的天然高分子化合物。自1823年 Odier 首先从五月金龟子的翅中发现几丁质,到1894年开始使用脱乙酰几丁质的名称并进行研究以来,没能引起人们的足够重视,直到近二十多年来,人们才开始对这些多聚物的研究产生兴趣,了解到它们在医学、纺织、食品等工农业各部门有着广泛应用前景。从1977年到1988年先后在美国、日本、意大利和挪威召开了四次国际会议,在几丁质的来源、结     

微生物几丁质酶研究进展及其在N-乙酰氨基葡萄糖制备中的应用

几丁质是自然界含量丰富的多糖,难溶于水,常被作为废弃物丢弃,造成资源浪费和环境污染。然而,其水解产物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能氨糖类化合物,广泛应用于医药、保健及护肤品等领域,市场需求量大。因此,将几丁质转换为高附加值的GlcNAc具有重要意义。几丁质酶可专一性水解几丁质产生GlcNAc,用于GlcNAc的酶法制备,从而替代化学加工方法,降低环境污染,提高产品质量。本文介绍了微生物来源几丁质酶的特点与分类,重点阐述了微生物来源的几丁质内切酶、几丁二糖外切酶及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在几丁质降解生产GlcNAc过程中的作用、方式和产率,这将为酶法生产GlcNAc提供一定的借鉴。     

细菌几丁质酶结构、功能及分子设计的研究进展

几丁质是仅次于纤维素的第二大天然多糖，由N-乙酰-D-氨基葡萄糖聚合而成，具有重要的应用价值。自然界中几丁质可被细菌高效降解。细菌可分泌多种几丁质降解酶类，主要分布在GH18家族和GH19家族中。细菌中几丁质降解酶基因存在明显的基因扩增及多结构域组合现象，不同家族、不同作用模式的几丁质酶系协同作用打破复杂的抗降解屏障，完成结晶几丁质的高效降解。因此，深入分析细菌几丁质酶结构与功能，对几丁质高效降解与高值转化应用具有重要意义。本文介绍了细菌几丁质酶的分类、结构特点与催化作用机制；总结了不同细菌胞外几丁质降解酶系的协同降解模式；针对几丁质酶家族分子改造的研究进展，展望了以结构生物信息学及大数据深度学习为基础的蛋白质工程设计策略在今后改造中的作用，为几丁质酶的设计与理性改造提供新的视角与思路。     

一种来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作用于肽聚糖或几丁质,从其非还原末端水解产生β-D-N-乙酰氨基葡萄糖单体,该酶在细胞壁代谢过程中起重要作用,在医药和生物技术领域也有广泛的应用。【目的】克隆表达来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703,为获得乙酰氨基葡萄糖单体奠定基础。【方法】以B.pseudofirmus703基因组DNA为模板,克隆得到了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因NagZ703,通过构建pET28a-nagZ703表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达NagZ703,利用镍柱纯化得到NagZ703纯蛋白,并对其酶学和生化性质进行分析。【结果】NagZ703与其同源蛋白多序列比对分析结果表明,NagZ703属于糖苷水解酶3家族(GH3),由2个结构域构成,催化活性中心由位于N端结构域的Arg232-His234-Arg318组成,和研究最多的Bacillussubtilis168来源的BsNagZ氨基酸的序列相似性为37%。酶学性质分析表明,以对硝基酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-β-GlcNAc)为底物,NagZ703的最适反应温度和pH分别为60°C和pH 6.5,比酶活为10.79 U/mg,其Km和Vmax分别为0.276 mmol/L和0.612 mmol/(mg·min)。该酶具有较好的稳定性,在50°C处理30 min,或在pH 6.0–10.5条件下,4°C保存12 h后,仍保留80%以上的酶活力。EDTA不影响该酶的活性,推测其为非金属依赖酶,且Hg2+可完全抑制酶活性。【结论】本研究将兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703来源的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703在大肠杆菌中成功表达和纯化,并分析了其酶学性质;NagZ703的最适pH为6.5,没有表现出耐盐嗜碱的特征;NagZ703能水解胶体几丁质产生GlcNAc,为酶解生产GlcNAc提供了一条可行的思路。     

里氏木霉几丁质酶表达及其水解产物组成与结构分析

优化并全合成里氏木霉几丁质酶基因,在毕赤酵母中实现分泌表达。产物几丁质酶的蛋白浓度达0. 17mg/ml,最适pH为5. 6,最适温度为65℃,酶活为0. 52U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物的组成及结构进行分析。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)检测及分析结果显示,酶解产物中包含至少41种聚合度2～18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分;核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)检测及分析结果显示,产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,非还原端则同时含有N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖。相关结果可为壳寡糖的结构与功能关系研究提供参考。     

几丁质酶的研究进展

几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类多糖,已从各种细菌、真菌、植物、哺乳动物和昆虫中分离并鉴定出来。随着近年来对几丁质及其衍生物的了解,发现此类多糖的物理化学特性在现实中有非常广泛的应用。几丁质酶是一类分解几丁质的酶,广泛分布于细菌、真菌、植物、哺乳动物、昆虫等物种中,并发挥着重要作用。近年来国内外工作者对这些不同来源的几丁质酶做了深入研究,为其在医学和农业上更广泛的应用提供理论基础。     

甲壳素脱乙酰酶的研究概况及展望

甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA,E.C.3.5.1.41)是一种能催化脱去甲壳素分子中N-乙酰葡糖胺链上的乙酰基,使之变成壳聚糖的酶。而壳聚糖因其独特的性质被广泛应用于医药、食品、化工、化妆品等行业。对CDA的来源、分离纯化和酶学性质、结构和催化机制、基因的克隆表达及应用前景等方面的研究进行了综述,并分析出今后的主要研究方向应在CDA基因的克隆表达、CDA底物的改造及CDA的结构和催化机制等方面。     

产几丁质酶菌株SWCH-6的筛选、鉴定及其产酶条件的优化研究

从汕头海湾养殖区域的海底沉积物中分离到1株几丁质酶活性较高的菌株,命名为SWCH-6,根据菌株的形态特征、生理生化特征和16S Rdna序列,确定该菌株为嗜水气单胞茵(Aeromonas hydrophlilla).采用单因素优化方法结合正交实验,得到菌株SWCH-6产几丁质酶的最佳发酵条件:胶体几丁质25.0g/L,胰蛋白胨10.0g/L,陈海水1.0L, Ph 8.5,32℃,150 r/min培养72h;在该条件下酶活力达0.39U/Ml.此外,菌株所产几丁质酶的最适催化Ph 5.0;最适催化温度为40℃;Cu2、Fe3及表面活性剂Tween-80能增强该酶的催化活性;Zn2 、Mn2 及表面活性剂SDS、洗衣粉对该酶的催化活性有抑制作用,与其它几丁质酶存在着一些不同.     

壳聚糖酶的研究进展

壳聚糖是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的碱性多糖。壳寡糖是壳聚糖的降解产物,具有良好的生物活性、溶解度及生物利用度,在医药、食品等领域有着广泛的作用。壳聚糖酶是一类特异性降解部分或完全脱乙酰壳聚糖的糖苷水解酶,因其降解效率高、反应温和可控而成为目前的研究热点。本文对壳聚糖酶的性质、结构、催化机制以及应用等方面进行了综述,总结梳理这些信息对于探寻目前壳聚糖酶研究中存在的一些问题以及今后的研究方向有重要意义,有助于促进壳聚糖酶的进一步开发利用。     

产几丁质酶菌株SWCH-6的筛选、鉴定及其产酶条件的优化研究

从汕头海湾养殖区域的海底沉积物中分离到1株几丁质酶活性较高的菌株, 命名为SWCH-6, 根据菌株的形态特征、生理生化特征和16S rDNA 序列, 确定该菌株为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlilla)。采用单因素优化方法结合正交实验, 得到菌株SWCH-6产几丁质酶的最佳发酵条件：胶体几丁质25.0 g/L, 胰蛋白胨10.0 g/L, 陈海水1.0 L, pH 8.5, 32℃, 150 r/min培养72 h; 在该条件下酶活力达0.39 U/mL。此外, 菌株所产几丁质酶的最适催化pH 5.0; 最适催化温度为40℃; Cu2+、Fe3+及表面活性剂Tween-80能增强该酶的催化活性; Zn2+、Mn2+及表面活性剂SDS、洗衣粉对该酶的催化活性有抑制作用, 与其它几丁质酶存在着一些不同。     

新抗生素和糖尿病治疗药物开发的靶标——葡糖胺-6-磷酸合酶

葡糖胺-6-磷酸合酶催化氨基己糖代谢和细胞壁合成的第一步反应,即利用D-果糖-6-磷酸和L-谷氨酰胺生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸,该途径的终产物N-乙酰葡糖胺是细菌和真菌细胞壁构建的基本成分.真菌、昆虫和甲壳类动物的几丁质,哺乳动物的糖蛋白和黏多糖都是通过N-乙酰葡塘胺最终合成的.葡糖胺-6-磷酸合酶是一个胰岛素调节酶,介导II型糖尿病的胰岛素抵抗.因此葡糖胺-6-磷酸合酶被认为是开发抗细菌、抗真菌、治疗II型糖尿病及其相关并发症等疾病的药物的分子靶标.     

几丁质及脱乙酰几丁质的微生物降解作用

几丁质及脱乙酰几丁质的微生物降解作用王士奎,王汉潜（廊坊师范专科学校生物系,河北廊坊１０２８４９）氨基糖（ＡｍｉｎｏＳｕｇａｒ）在自然界中主要以多糖（几丁质、肽聚糖、糖蛋白、粘多糖等）形式存在。其中,几丁质作为多数真菌和无脊椎动物的主要结构成份,在自...     

Flavobacterium johnsoniae昆布多糖酶的分离纯化及其催化性质

约氏黄杆菌Flavobacterium johnsoniae具有分泌裂解酵母细胞壁酶系的能力,经初步分析发现其发酵液中具有葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等活性。通过离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析,从该菌发酵液中分离纯化到一种昆布多糖酶。该酶分子量为35 kD左右,其最适反应温度为50°C,最适反应pH为5.0。以昆布多糖和昆布寡糖为底物的反应表明,该酶以内切酶作用模式进行催化水解。     

柠檬酸合酶的分子生物学研究进展

柠檬酸合酶（citrate synthase,CS）是细胞内多种重要代谢途径的关键酶。CS可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶A。通常革兰氏阳性细菌、古菌以及真核细胞的CS为同源二聚体,而革兰氏阴性细菌的CS为同源六聚体。根据其在细胞内的定位不同,CS可分为线粒体CS、乙醛酸循环体CS、过氧化物酶体CS。这些同工酶在能量代谢、植物脂肪的代谢、脂肪酸的氧化及细胞解毒过程中起着重要作用。不同来源的CS空间结构、催化机制和动力学性质十分相似。针对其生化特性、空间结构特点、催化机制以及分子进化等研究进展进行综述。     

多粘杆菌中合成乙酰乳酸酶系的压制与诱导

多粘杆菌中合成乙酰乳酸酶系的合成,受其所催化的反应的终末产物,缬氨酸、异白氨酸和白氨酸所抑制。有些不属于合成乙酰乳酸酶系所参予催化的反应的终末产物如甲硫氨酸,赖氨酸,苏氨酸,半胱氨酸和高胱氨酸等,对该酶的合成亦有抑制作用。生长在豌豆汁营养培养基上的细菌内,测不出合成乙酰乳酸酶系的活力,当加入葡萄糖后,酶的合成速率显著增加。葡萄糖有抵制缬氨酸对合成乙酰乳酸酶系的合成的抑制作用。而葡萄糖对这个酶的去压制作用不能为甘油或丙酮酸所代替。作者对甲硫氨酸、赖氨酸和苏氨酸等对合成乙酰乳酸酶系的合成的抑制作用,以及葡萄糖对这个酶的诱导现象进行了讨论。     

植物几丁质酶的生物功能

几丁质酶(ＥＣ3.2.1.14)是一种能降解几丁质(Ｎ乙酰氨基葡萄糖线性聚物)的糖苷酶。已经发现多种微生物、动物、植物都可产生几丁质酶。就植物而言,几丁质酶不仅存在于被子植物的双子叶植物和单子叶植物,而且也存在于裸子植物及蕨类植物中[1]。在植株中,几丁质酶可分布于根、茎、叶、花器、果实、种子诸器官。种子、根、花器中的几丁质酶含量一般较其它器官高。在正常情况下,植物中几丁质酶活性较低,但经诱导因子诱导,活性会迅速升高。真菌、细菌、病毒的侵染,真菌和植物细胞壁的组成成分,多糖等诱导物,伤害,乙烯,有机分子如水杨酸、氨基酸类…     

组蛋白脱乙酰酶抑制剂的抗癌作用

组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶分别催化组蛋白的乙酰化和脱乙酰基反应,调节组蛋白的乙酰化水平,从而调控基因表达。这些过程与恶性肿瘤的发生具有密切的关系。组蛋白脱乙酰酶抑制剂通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度,调节多种基因的表达水平,抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞分化和凋亡。该文从抑制细胞增殖、诱导细胞分化、诱导细胞凋亡和抗血管形成等4个方面介绍组蛋白脱乙酰酶抑制剂的抗癌机制,并简要介绍它们的分类。     

产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究

筛选并鉴定高产几丁质酶的芽孢杆菌菌株,旨在研究其酶学特性为高效利用几丁质酶资源奠定基础。分离纯化产几丁质酶芽孢杆菌,将目的菌株的几丁质酶基因异源表达并纯化后研究其酶学参数。考虑到菌株的生物安全性,选择侧孢短芽孢杆菌CDY64为进一步研究对象,将其几丁质酶基因表达于大肠杆菌BL21中。酶学研究表明,纯化后的几丁质酶最适反应温度为60℃,在p H6.0-8.0范围内均表现出良好的活性;使用胶体几丁质作为底物时Km与kcat值分别为5.85μmol/L和29.27 S-1。结果表明,侧孢短芽孢杆菌CDY64所产几丁质酶在高温下具有良好的催化能力,在体外对多种植物病原真菌表现出了良好的拮抗作用。