应用细胞工厂传代原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒

目的应用细胞工厂建立原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞传代培养工艺,培养狂犬病病毒,为PHK细胞和人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的规模化放大奠定基础。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,经消化分散接种到细胞工厂中,在37℃下培养筛选出PHK细胞静置培养的最适细胞接种密度;在最适细胞接种密度下,从0.20%水解乳蛋白MEM培养基和改良的DMEM/F12培养基中筛选出更适宜地鼠肾细胞静置培养的培养基;同时对消化液A(含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.25%胰蛋白酶溶液)的消化效果进行比对,选择适宜的消化液;最后,使用最佳培养基和消化液对PHK细胞进行传代,观察细胞生长情况并分析代谢水平;对同一细胞批不同代次的单层细胞(P0代、P1代和P2代)接种狂犬病病毒aG株,进行多次收获,检测单次病毒收获液病毒滴度。结果 PHK细胞(P0代)在细胞工厂中适宜的接种密度为0.30×10~6～0.50×10~(6 )cells/cm~2;改良的DMEM/F12培养基和消化液B更适用于PHK细胞的培养和消化传代;在40层细胞工厂(CF40)中使用最佳培养基和消化液传代地鼠肾细胞至第4代(P4代),随着代次的增加,收获的细胞密度降低、葡萄糖消耗减少和乳酸生成下降;P0代、P1代和P2代细胞均有较佳的细胞状态和增殖能力;用P0代、P1代和P2代细胞培养狂犬病病毒,能有效收获4次,且单次病毒收获液病毒滴度结果符合要求,差异无统计学意义(P0.05)。结论成功建立了PHK细胞传代培养工艺,为PHK细胞的规模化放大,冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进、变更以及产能的扩大提供了参考。     

类弹性蛋白多肽的从头设计、非色谱纯化及盐效应

近年来,因病毒侵害人类每年都要蒙受巨大的经济损失和社会损失。犬肾细胞MDCK以其具有的培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高等特点,成为适用于流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一。以MDCK细胞为研究对象,在自制无血清培养基中成功实现了MDCK细胞从有血清培养到无血清培养的驯化;并通过单细胞悬浮培养驯化过程实现了MDCK细胞的无血清单细胞悬浮培养,获得了适于无血清单细胞悬浮生长的ssf-MDCK细胞株,无血清单细胞悬浮批培养最大活细胞密度可达3.81×106 cells/mL,最大比生长速率可达0.056 h?     

CHO工程细胞株低血清培养的初探

以DMEM: F12(1: 1)为基础培养基,对CHO细胞的低血清培养进行了初步探索,降低培养基中血清含量,观察了细胞在10%、5%和1%等不同浓度低血清培养条件下生长状态和外源蛋白表达活性的变化.试验结果表明:在含1%血清的F12: DMEM(1: 1)培养基中,细胞仍能保持良好的生长状态,且培养上清中的目的蛋白活性与常规血清浓度10% DMEM培养条件下的活性接近.从而达到了既可以降低生产成本,又可以降低纯化难度的目的.     

甲状旁腺激素PTH1—34对成骨细胞的机械应答的影响

目的：探讨PTH对成骨细胞在机械载荷状态下的功能影响。方法：人成骨样细胞株MG63复苏培养,采用163mOsm低渗液作为刺激源,实验分为三组,A组为单纯用DMEM培养基培养;B组为低渗液对成骨细胞分别作用0．5h、2h、4h和6h;C组为低渗处理同期加入hPTH1-34（20ng／L）。检测细胞内钙离子浓度[Ca2＋]、细胞凋亡指数以及增殖活力的变化。所得结果采用单因素方差分析法。结果：随着培养时间延长,[Ca2＋]i升高,以B组升高最为明显,（与A组比较p〈0．05）,A组和C组比较p〉0．05;细胞凋亡指数在B组4h和6h为最高（29．38±0．336;54．87±0.781）,明显高于A组和C组,且与两组相比均p〈0．05,C组4h凋亡率低于A组（p〈0．05）,其它时间组统计学比较p〉0．05。细胞增殖活力随着培养时间增加逐渐增加,与A组和C组同期相比,B组较低,且p〈0.05。结论：过强的低渗牵张作用对细胞有损害作用,[Ca2＋]i降低,凋亡率增加且降低增殖活性;PTH通过维持[Ca2＋]i浓度,对细胞的功能具有保护作用。     

甲状旁腺激素PTH 1-34对成骨细胞的机械应答的影响

目的：探讨PTH对成骨细胞在机械载荷状态下的功能影响。方法：人成骨样细胞株MG63复苏培养,采用163mOsm低渗液作为刺激源,实验分为三组,A组为单纯用DMEM培养基培养;B组为低渗液对成骨细胞分别作用0．5h、2h、4h和6h;C组为低渗处理同期加入hPTH1-34（20ng／L）。检测细胞内钙离子浓度[Ca2＋]、细胞凋亡指数以及增殖活力的变化。所得结果采用单因素方差分析法。结果：随着培养时间延长,[Ca2＋]i升高,以B组升高最为明显,（与A组比较p〈0．05）,A组和C组比较p〉0．05;细胞凋亡指数在B组4h和6h为最高（29．38±0．336;54．87±0.781）,明显高于A组和C组,且与两组相比均p〈0．05,C组4h凋亡率低于A组（p〈0．05）,其它时间组统计学比较p〉0．05。细胞增殖活力随着培养时间增加逐渐增加,与A组和C组同期相比,B组较低,且p〈0.05。结论：过强的低渗牵张作用对细胞有损害作用,[Ca2＋]i降低,凋亡率增加且降低增殖活性;PTH通过维持[Ca2＋]i浓度,对细胞的功能具有保护作用。     

胎鼠中脑多巴胺细胞混合培养方法探索

目的 探索一种新的胚胎大鼠腹侧中脑黑质细胞的混合培养方法,以获得具有高比例多巴胺神经元的原代细胞体系,有利于在体外条件下进行帕金森病(Parkinson's disease,PD)的发病机制和防治的研究.方法 分离E15 (Embryonic Day 15)SD胎鼠中脑黑质区域组织,分散为单细胞后,分别用DMEM/F12+ 10％FBS含血清培养基和Neurobasal+ N1无血清培养基设置不同组别进行培养,通过免疫组织化学方法检测在不同培养条件下细胞的生长状态及多巴胺能神经元的比例.结果 DMEM/F12+ 10％ FBS与Neurobasal+ N1先后一周交替换液的的培养体系中获得的TH阳性神经元占神经元的比例可达31％左右,明显高于单独使用DMEM/F12+ 10％ FBS培养组(约10％).结论 DMEM/F12+ 10％ FBS与Neurobasal +N1先后一周交替换液是一种黑质神经元和胶质细胞混合培养并能获得高比例多巴胺神经元的有效培养方法.     

转录因子E2F1和PCNA在分离、培养的人视网膜色素上皮细胞中的表达及意义

为探讨转录因子 E2 F1及增殖细胞核抗原 (PCN A)在增生性玻璃体视网膜病变 (PVR)中的作用 ,采用 SABC免疫细胞化学法检测转录因子 E2 F1和 PCNA在无血清组及 2 0 %血清组培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPE)中的表达。结果显示在无血清组中 ,转录因子 E2 F1表达的阳性率为 2 .4%± 0 .2 5 % ,而未见 PCNA表达 ;在 2 0 %血清组中 ,E2 F1及 PCNA的表达阳性率分别为 2 9.1%± 0 .71%和 48.6 %± 1.13%。说明 E2 F1和 PCNA蛋白的表达取决于人 RPE细胞的生长状态 ,在增殖活跃的细胞中表达增高 ;转录因子 E2 F1调控人 RPE细胞中 PCNA蛋白的表达。提示转录因子 E2 F1调控人 RPE细胞的细胞周期进展 ,在 PVR的形成中也发挥着关键性的作用     

流感病毒生产的维持培养基开发及细胞代谢特征分析

采用Simplex Lattice设计开发出适于流感病毒在MDCK细胞中高效扩增的维持培养基,同时以细胞生长培养基作为对照组,研究该培养基下病毒感染后的细胞代谢特征。通过统计学方法,确定维持培养基由A和F培养基以0.586∶0.432比例混合组成,在2 L生物反应器中其所支持的最大病毒滴度为214.062 HAU/100μL,较对照组提高了59.55%。代谢分析表明,在葡萄糖初始浓度一致的条件下,维持培养基组增强了细胞对葡萄糖的摄取及糖酵解途径,对于利于病毒增殖的组分,如丝氨酸、精氨酸、异亮氨酸等,细胞的消耗速率显著增强;对于抑制病毒扩增的组分,如丙氨酸,细胞的生成速率大幅度下降。该研究方法和所得的关键细胞代谢特征对于其他病毒疫苗培养基的开发和优化提供了方法借鉴和理论指导。     

黄连素对小鼠S-180移植瘤的抑制作用

[目的]利用S-180荷瘤小鼠及细胞研究黄连素抑制肿瘤的作用及分子机制。[方法]利用免疫组织化学染色、WST1实验、流式细胞术及Real-time PCR等技术,检测黄连素抑制S-180肉瘤细胞的作用及机制。[结果]体内实验结果表明黄连素组生存时间明显延长(P 0. 05),抑瘤率为25. 19%,肿瘤直径(2. 11±0. 39)显著小于对照组(2. 48±0. 20),磷酸化组蛋白H3及Cyclin D1阳性细胞数目明显降低(P 0. 05)。体外实验结果表明黄连素可以抑制S-180细胞的生长,并诱导凋亡(P 0. 05),Real-time PCR结果表明,黄连素组C-myc、Cyclin D1、Bcl-2及FAS表达水平降低,Caspase-1及PGC-1α表达水平升高(P 0. 05)。[结论]黄连素在体内水平抑制S-180荷瘤小鼠肿瘤的增殖,延长生存时间,在体外水平抑制S-180细胞的生长并诱导凋亡,黄连素通过调控增殖、凋亡及代谢等相关基因发挥抗肿瘤作用。     

RGS16基因抑制肺癌发病进展的功能研究

[目的]研究RGS16基因对人肺癌发病及进展的作用。[方法]构建过表达慢病毒载体Lenti-RGS16,感染A549细胞,以CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕实验、FITC/PI染色法检测A549细胞行为包括增殖、克隆形成、迁移、凋亡率变化,以裸鼠成瘤实验检测A549细胞体内生长。[结果]A549细胞中RGS16基因表达量提高3. 6倍,细胞生长、增殖及迁移能力分别降低73%、62. 8%、88%,细胞凋亡率增加3倍;在动物成瘤实验终点时,RGS16过表达组的肿瘤体积比对照组显著减少(240 vs 1090 mm3),瘤体重量也显著降低(0. 33 vs 0. 95 g)。经分析TCGA数据库发现RGS16基因在肺癌组织中表达比正常对照组织中减少52. 8%。[结论] RGS16基因抑制肺癌A549细胞生长、增殖及迁移,促进细胞凋亡。     

国产和进口DMEM培养基培养CHO—C28工程细胞的质量评价

我们用10L转瓶培养能高效表达HBsAg的重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO-C_(28)细胞株),在相同的培养条件下比较国产和进口DMEM培养基的质量。结果表明,两种DMEM培养的细胞之生长及分泌的HBsAg之滴度没有显著改变,国产DMEM培养的细胞收液的沉淀收率略高于进口DMEM的,前者的最后收率也不低于后者。两种DMEM培养的细胞收液经纯化后,HBsAg的各项指标都符合基因工程乙肝疫苗制造及检定规程的标准,从试验结果可以看出,用国产DMEM培养基替代进口DMEM培养基是完全有可能的。     

N、P营养盐胁迫对两株布朗葡萄藻生长的影响

采用批次培养方法,在光照强度60、110mol/m2s下分别设置了7个不同的氮、磷浓度(N:0-3500g/L,P:15-775g/L),研究两株布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)对氮、磷胁迫的敏感性差异,筛选高营养利用效率的优良藻株。结果表明:两株藻对氮磷营养胁迫的耐受性存在差异,B.braunii764株对氮胁迫具有较高耐受性,而B.braunii765株对磷胁迫具有较高耐受性。光照强度110mol/m2s,不同氮浓度下B.braunii764株其平均生长速率均显著高于其他各处理组;不同磷浓度下B.braunii765株其平均生长速率显著高于B.braunii764株。在试验设定的光照强度条件下,适当增加光照强度能够显著降低氮胁迫对布朗葡萄藻生长的抑制效应。在光照强度110mol/m2s下,氮浓度3500g/L时两株布朗葡萄藻平均生长速率与在正常Chu-10培养基条件下无显著差异。磷浓度775g/L时两株布朗葡萄藻的平均生长速率均显著低于正常Chu-10培养基条件,增加光照强度对磷胁迫下藻细胞的生长无显著作用。两株布朗葡萄藻在第2天时磷吸收与初始磷浓度呈正相关关系,氮吸收在3500g/L时出现饱和现象。布朗葡萄藻的生长更容易受到培养基中磷营养胁迫的影响。       

微载体浓度与细胞接种密度对ST细胞生长的影响

选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率,优化微载体培养体系猪睾丸细胞(Swine testicle cells)的贴附生长与维持。使用DMEM补加10%血清、LSM(Low serum medium)两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对细胞生长维持的影响,进而比较ST细胞在不同条件下对Cytodex1微载体的利用率。结果显示,使用LSM在T150方瓶中连续传代培养30d,平均比生长速率为0.626d~(0-1),是DMEM补加10%FBS培养基的1.15倍。选择10×10~5cells/mL细胞接种3g/LCytodex1搅拌瓶体系,最大细胞密度为38.3×10~5cells/mL,微载体利用率上升到58.8%。在灌注培养体系中培养ST细胞15d,最终细胞密度达到36.6×10~5cells/mL,扩增了13.6倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于ST细胞的贴附与生长,实现高密度生长,另一方面增加了微载体的使用成本,选择合适的微载体浓度、细胞接种密度,能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞的最优生长。     

Mixture与响应面法结合开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基

采用Mixture与响应面实验设计相结合的方法开发BHK-21细胞无血清悬浮培养基。在实验室已知配方的6种培养基A-F的基础上,通过Mixture实验筛选出BHK-21细胞无血清培养基的最优组合为A∶B∶C∶D∶E∶F=0∶0∶11∶0∶9∶0。利用响应面法针对培养基中的几种关键组分进行浓度优化,确定谷氨酰胺、酪氨酸、牛血清白蛋白和钙离子的最优浓度分别为3 mmol/L、2.5 g/L、0 g/L和0 mmol/L。该无血清悬浮培养基能很好地支持BHK细胞悬浮生长,培养时细胞最大活细胞密度可达140.21×105个/m L,比商业培养基提高了1.95倍。采用Mixture试验设计和响应面分析法能够在较短的时间内开发出适合BHK-21细胞生长的无血清悬浮培养基,为采用BHK-21细胞大规模工业化生产口蹄疫疫苗奠定了基础。     

极小曲丝藻生长与光合活性对硅浓度的响应

为探究南水北调中线干渠硅藻快速增殖与硅浓度间的内在关系, 选取干渠全年优势种极小曲丝藻(Achnanthidium minutissimum)为研究对象, 研究不同初始硅浓度(0、2、4、6和8 mg·L−1)对极小曲丝藻生长和光合生理特性的影响。结果显示, 不同浓度硅对极小曲丝藻比生长速率具有显著影响(P<0.05)。硅浓度0 mg·L−1时, 细胞密度、比生长速率、叶绿素a浓度、类胡萝卜素浓度和光合系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学效率(Fv/Fm)相对于添加硅的试验组, 均显著降低(P<0.05), 未出现明显的叶绿素荧光诱导曲线(OJIP)特征, 检测不到光合放氧。随硅浓度升高(28 mg·L−1), 藻细胞密度、比生长速率和最大现存生物量均明显上升; 硅浓度2 mg·L−1处理组的细胞叶绿素a和类胡萝卜素浓度均显著低于另外3个硅处理组(P<0.05)。硅浓度4 mg·L−1、6 mg·L−1和8 mg·L−1处理组的细胞叶绿素a和类胡萝卜素浓度、Fv/Fm和光合放氧速率均无显著差异。研究表明硅是硅藻快速增殖的限制因素; 中线干渠内硅浓度较高(约5 mg·L−1), 满足硅藻大量增殖需要, 是导致硅藻快速增殖、占据优势的重要因子。     

无血清共培养条件下脐带间充质干细胞对奶牛乳腺上皮细胞的增殖作用（英文）

目的旨在探究无血清共培养条件下脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cells,BMECs)的增殖作用。方法选取生长状态最佳的UC-MSCs和BMECs,将两种细胞以直接接触和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UCMSCs:BMECs分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单纯培养组,并设阴性空白对照,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果在48 h,条件培养基BMECs组A值显著高于对照组(P0.05),而1∶2浓度组A值达到峰值,极显著高于对照组(P0.01),显著高于其他各浓度组和条件培养基BMECs组(P0.05)。结论无血清条件下,UC-MSCs和BMECs共培养可以促进BMECs增殖,直接接触促增殖效果优于间接接触,且最适比例为1∶2,最佳时间是48 h。     

缺血性心脏病患者血清对血管内皮细胞增殖的影响

目的:探讨不同阶段缺血性心脏病患者血清对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的影响。方法:采集正常健康人群组(A组)、缺血性心脏病高危人群组(B组)、缺血性心脏病急性期患者组(C组)、缺血性心脏病稳定期患者(D组)的血清,分别作用于人脐静脉血管内皮细胞不同时间,通过MTT比色法,检测细胞的生长抑制率,观察其对HUVEC增殖的影响。结果:四组血清处理HUVEC 24、48、72、96小时后,B组、C组和D组的细胞生长抑制率均显著低于A组(P0.05),且C组和D组24小时的生长抑制率显著低于B组(P0.05),D组48、96小时显著低于B组(P0.05),D组96小时显著低于C组(P0.05)。随着观察时间的延长,A、B、C组患者血清的促增殖作用逐渐增强,48 h、72 h和96 h的生长抑制率均显著低于同组24 h(P0.05);A组患者血清培养至96 h,生长抑制率与同组48 h比较显著降低(P0.05)。结论:从高危患者发展至缺血性心脏病,以及心血管疾病在度过急性期后,随着病程和生存期的延长,其血清对细胞的促增殖作用逐渐增强。     

MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究

MDCK细胞对各种流感病毒具有高度敏感性,广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备.通过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分,并筛选水解物,开发了适合MDCK细胞生长的低血清培养基.发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质,麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清.利用该低血清培养基,经过消化转移将MDCK细胞从5L反应器放大至25 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,25 L反应器中培养48 h细胞密度可达30.5×105 cells/ml.研究结果为工业规模反应器微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒奠定了基础.     

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。     

腺嘌呤对体外小鼠卵母细胞减数分裂的抑制

本文研究了嘌呤类物质对小鼠卵母细胞减数分裂的影响。于卵母细胞的生发泡内显微注射腺嘌呤和腺嘌呤的类似物苄基腺嘌呤可显著抑制卵母细胞的分裂的重新启动。同时发现在腺嘌呤的作用过程中,腺苷酸环化酶的激活剂氟化钠可增强其对卵母细胞的抑制作用,表明cAMP途径在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中起重要作用。腺嘌呤在不同培养液中的抑制效果不一,次黄嘌呤在DMEM和EMEM中对小鼠的卵丘细胞-卵母细胞复合体(COC)和无卵丘细胞的裸卵(DO)均具有明显的抑制效应。但腺嘌呤在DMEM比在EMEM中对COC的抑制效果更强,而且腺嘌呤在DMEM中与次黄嘌呤具有协同效应,这些差别可能是由于两种培养液中不同成分如谷氨酰胺造成卵母细胞对腺嘌呤吸收差异而引起的。