重组蛋白包涵体的复性研究

重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往形成不可溶、无生物活性的包涵体,需经过变性溶解后,在适当条件下复性形成天然的构象,才可恢复其生物活性．变复性实验是建立在对蛋白质体外折叠机制的了解的基础上．根据近年来对蛋白质折叠机制的认识和重组蛋白包涵体在复性方面的主要进展,论述以下3个方面的内容：1)蛋白质在细胞内的折叠机制;2)蛋白质体外折叠机制;3)蛋白质复性的策略和方法．     

重组抗血红素ScFv包涵体蛋白的复性及纯化研究

抗血红素多二硫键ScFv在大肠杆菌中绝大多数表达产物为包涵体,为了获得可溶性的具有生物活性的ScFv,摸索了不同的复性条件,包括透析法、稀释和层析相结合的方法。研究发现,先对溶解的变性ScFv溶液稀释,进行初步的蛋白质复性,再利用Sephadex G-25凝胶层析进一步复性、降低变性剂浓度和纯化,至少可以得到95％纯度,产率为150mg／L的目标蛋白,通过一次凝胶过滤层析,达到了去除变性剂、复性及纯化ScFv蛋白三种目的,为多二硫键ScFv在大肠杆菌中的表达和纯化提供了一种经济可行的方法。     

重组包涵体蛋白质的折叠复性

综述了减少包涵体形成、包涵体分离和溶解以及包涵体折叠复性的策略及其最新进展 .详细讨论了包涵体蛋白质折叠复性的基本原则、包涵体折叠复性促进剂和包涵体折叠复性方法     

包涵体蛋白复性技术研究进展

本文对原核表达的包涵体蛋白的分离,洗涤,溶解及复性方法做了一个简单的总结。同时就国内外近几年的最新复性方法进行了概述。并分析了各种复性方法的利弊。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

重组血管内皮细胞生长因子包涵体复性条件研究

利用大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３） 表达血管内皮细胞生长因子１６５（ ＶＥＧＦ１６５） ,表达蛋白以包涵体形式存在。为了获得大量有生物活性的蛋白质,我们对影响复性的参数：氧化型、还原型谷胱甘肽比例,复性液的ｐＨ 值,复性时间,精氨酸浓度以及血管内皮细胞生长因子（ ＶＥＧＦ１６５） 包涵体的起始浓度进行了较为系统的研究,初步获得了具有一定生物活性的ＶＥＧＦ１６５ 二聚体蛋白。     

包涵体蛋白的层析复性技术研究进展

包涵体蛋白的复性是生物工程下游技术中的一个重要难题。层析法用于蛋白质复性是一种较新的、适用于大多数蛋白的方法。其原理是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化,使变性蛋白质在层析柱上重折叠为正确的空间构象,在洗脱的同时实现部分纯化。本文详细介绍了蛋白质在5种层析柱上的复性方法、原理、应用及研究的新进展,为层析法对蛋白质复性的进一步应用提供依据。     

包涵体蛋白复性的几种方法

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。     

VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究

[目的]构建VISTA-Ig融合蛋白表达载体,进行诱导表达获得VISTA-Ig融合蛋白。[方法]以C57BL/6小鼠脾脏细胞c DNA为模板,扩增小鼠VISTA胞外段基因,利用重叠延伸PCR的方法合成VISTA-Ig融合基因,构建重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,在大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达。[结果]VISTA-Ig融合蛋白主要以包涵体的形式存在。变性后,利用镍柱纯化,通过采用氧化型/还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG)复性体系,复性效率达到80%以上,提高了复性效率。利用r Protein A柱对目标蛋白进一步纯化,Western Blot鉴定结果显示,能与Ig G Fc(HRP)抗体特异性结合。[结论]成功构建了重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,纯化的VISTA-Ig包涵体蛋白复性效率得到明显提高,为后续VISTA-Ig免疫学功能的研究奠定了基础。     

重组人表皮生长因子包涵体的表达、纯化及复性

目的:通过优化人表皮生长因子(hEGF)基因序列,利用大肠杆菌大量表达重组hEGF(rhEGF)包涵体,经过包涵体纯化复性获得高活性的rhEGF。方法:采用全基因合成优化后的序列,克隆至pET-30a表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,将rhEGF包涵体用尿素溶解后过Ni柱纯化并稀释复性,根据药典对得到的rhEGF进行纯度及活性测定。结果:构建了rhEGF的表达载体pET-30a-rhEGF,表达出的蛋白主要存在于包涵体中,相对分子质量为6.5×10~3,包涵体经过纯化复性后获得的rhEGF纯度可达92.8%,生物活性约4.94×10~7IU/mg。结论:得到了具有较高活性的rhEGF。     

重组Hepcidin融合蛋白的氧化复性及活性鉴定

将诱导表达的His-hepcidin融合蛋白包涵体通过固定化金属离子配体亲和层析(IMAC)柱分离纯化后,在cys-teine/cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键,稀释复性后用肠激酶将融合蛋白的his-tag切除。酶切后所得的Hepcidin经抑菌圈试验检验,对枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有抗菌活性。     

包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展

重组蛋白在大肠杆菌中表达多为无活性的包涵体形式,须经洗涤、溶解、复性后才能得到生物活性蛋白。综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和复性技术研究进展,重点讨论了色谱法复性技术的应用,包括尺寸排阻色谱、亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化脂质体色谱、扩张床吸附色谱的进展情况。     

融合牛肠激酶轻链EKL包涵体蛋白的复性纯化

大肠杆菌高密度发酵表达肠激酶轻链融合蛋白DsbA-rEKL,主要以包涵体形式存在。包涵体经4mol/L尿素和0.5%TritonX-100洗涤,以6mol/L盐酸胍、100mmol/LDTT溶解,在胱氨酸存在下,以脉冲加样方式复性。融合蛋白复性在6mmol/L胱氨酸存在下、脉冲加量0.03mg/mL和复性终蛋白浓度0.3mg/mL为最佳复性方案。复性的融合蛋白加2mmol/LCaCL2后快速自切。经IDA-Sepharose及Q-Sepharose纯化,rEKL纯度可达95%以上,可高效酶切重组瑞特普酶融合蛋白Trx-rPA。实现了大规模生产rEKL,每升发酵液经复性及纯化后,可得rEKL60mg/L以上,使以融合蛋白表达rPA等药用蛋白成为现实。     

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的稀释复性

N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶（N-Acetylornithine deacetylase,NAO）是一种重要的用于手性拆分的酶,具有广泛的底物选择性,常用于多种活性氨基酸的酶法拆分。采用稀释复性法研究了重组NAO包涵体的复性条件,如蛋白浓度、复性液中尿素浓度、pH、GSH浓度及c（GSH）/c（GSSG）比例,同时对稀释操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件。结果表明,尿素能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,随着蛋白质浓度的增加,复性效果变差。当复性缓冲液中尿素浓度为2 mol/L,GSH浓度为5 mmol/L,c（GSH）/c（GSSG）为2.5,pH为8.5,在4℃下进行分批稀释复性操作,复性后重组NAO的活性为1.077 U/mL,比酶活达到14.943 U/mg,与可溶性表达的NAO比较,复性率达到21.48%。     

大肠杆菌表达的重组琼胶酶包涵体的纯化与复性条件研究

琼胶酶(agarase)是一类能够降解琼脂糖的糖苷水解酶,在保健食品、医药、化妆品等行业极具应用价值。本研究旨在纯化大肠杆菌BL21(DE3)ply Ss表达的以包涵体状态存在的重组琼胶酶rAga0917,并对纯化的包涵体蛋白的复性条件进行优化,以获得大量高活性的琼胶酶蛋白。用单因素实验,每次以单一复性条件为变量,用透析复性法探索了初始蛋白浓度、透析时间、温度、非离子去垢剂Triton X-100、甘油等对重组琼胶酶rAga0917包涵体复性的影响。实验结果显示,通过Ni~(2+)柱亲和层析,获得了纯度95%以上的蛋白。纯化蛋白浓度低于65μg/m L时,复性蛋白的酶活性与初始蛋白浓度成正比;4℃复性的蛋白,其琼胶酶活性明显高于25℃;随着透析时间的增长,复性效果越来越好;实验还同时发现复性液中的甘油能有效地辅助重组琼胶酶rAga0917复性。     

包涵体复性研究进展(英文)

用基因工程技术在大肠杆菌高水平表达重组蛋白时,通常形成无生物活性的包涵体。包涵体在体外经分离、溶解与重折叠后可实现复性,表现为具有生物活性的蛋白。总结了包涵体的相关复性技术,重点介绍重折叠的最新进展情况 。     

人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性

目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。     

SARS冠状病毒Mc区原核表达及包涵体复性的研究

构建SARS冠状病毒M蛋白膜内区(Mc蛋白)基因(Mc区)融合表达载体,表达并复性该蛋白。克隆Mc区,构建融合表达载体pET-32a(+)/Mc,融合表达Mc蛋白。纯化表达蛋白,采用逐步透析、降低蛋白浓度、加入氧化还原剂复性融合蛋白。用复性蛋白免疫兔产生抗血清,复性蛋白与SARS患者血清和健康人血清反应鉴定复性结果。结果显示,复性蛋白免疫家兔后产生抗血清,该复性蛋白与SARS患者血清特异结合,表明已成功复性该表达蛋白。为SARS疫苗和诊断试剂的研制奠定基础。     

EC-SOD包涵体的柱上复性、纯化及稳定性研究

利用H is-tag与金属离子的特异结合作用,通过金属(N i)亲和层析对EC-SOD包涵体进行柱上复性。考察蛋白上样量、尿素脱除速率和复性温度对复性效率的影响。利用N i-sepharose和Heparin-sepharose亲和柱对重折叠后的蛋白进行纯化,并研究复性蛋白的稳定性。结果表明,利用N i-sepharose亲和柱可以对EC-SOD进行复性,上样量越大,尿素脱除速率越快,复性效率越低;温度升高,复性效率增加。N i-sepharose对复性后蛋白具有纯化作用,经Heparin-sepharose亲和柱纯化后蛋白比活明显提高。复性蛋白在10℃~50℃温度范围内活性稳定,pH低于5大于10时,其稳定性显著降低,在尿素和盐酸胍溶液中复性蛋白的稳定性较弱。