乙型肝炎免疫指标全阴的原发性肝细胞癌患者体内HBV-DNA的检测及研究

本文以聚合酶链式反应(PCR)对35例乙型肝炎免疫指标(HBVm)全阴性的原发性肝细胞癌(PHC)患者血清、外周血单核细胞(PBMC)、肝活检标本进行乙型肝炎病毒HBV-DNA 检测,其检出率分别为34.29%、60.00%、68.57%。说明一部分血清 HBVm 全阴性的 PHC 患者血清并非无传染性,ELISA 法具有一定的局限性。PBMC 内有相当的HBV-DNA 存在,这对于研究 PHC 患者体内 HBV 的存在情况、各型乙型肝炎患者的传染性及疗效的评价提出了新课题,具有十分重要的意义。HBVm 全阴的 PHC 患者肝细胞内 HBV-DNA 有很高的分布,二者有明显的相关关系,支持 HBV 对 PHC 有较高致病性研究。本文结果还显示 PCR 法具有较高的敏感度,对研究 HBV 对人类的感染、在患者体内的分布情况及血清传染性等都具有较高的价值。     

乙型肝炎病毒变异与肝细胞癌发生关系

乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）基因组复制时,以病毒前基因组RNA作为模板合成子代病毒DNA,催化该过程的逆转录酶缺乏校对功能,所以HBV易出现变异。近年来,各国学者通过比较肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者和非HCC患者的HBV基因序列,发现HBV基本核心启动子区的A1762T／G1764A变异或T1753V变异、增强子Ⅰ区的G1053A或G1229A变异、前S蛋白的F141L变异、前s2区基因缺失变异和x基因的截短变异,分别是HCC的易患因素,而前c区常见的G1896A变异,与HCC的发生无关。增强子Ⅱ区的C1653T变异在c基因HBV感染中可能与发生HCC有关,而在A基因型可能无关。     

HBV—DNA的生物素寡聚核苷酸探针快速检测

本文建立一种快速ＨＢＶ－ＤＮＡ检测方法,此法是基于生物素标记的寡聚核苷酸与硝酸纤维素滤膜上的靶ＤＮＡ杂交,然后通过Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ－碱性磷酸酶偶联体及生色底物进行检测。本文研究了此法的实用性,表明对于实验室及临床的ＨＢＶ－ＤＮＡ检测,此法是一种快速（４小时）、灵敏（１－１０ｐｇ）、特异、方便的方法。     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究进展

预防与控制乙型肝炎发病的乙型肝炎病毒(HBV)疫苗,是有重大的社会和经济意义。HBV的持续感染可引起慢性肝脏疾患,并逐步发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。目前的乙肝重组亚单位疫苗可以使90％的接种产生保护性抗体;但是对慢性HBV携带,由于其机体对HBsAg蛋白产生耐受,不能产生体液和细胞免疫,因此它只能作为一种预防性的疫苗。DNA疫苗(基因疫苗)是一种新的疫苗技术,通过向体内递送编码抗原的细菌质粒,刺激产生特异的体液和细胞免疫反应。在小鼠和其他的肝炎病毒感染动物模型中,HBV DNA疫苗可以特异性地引起体液和细胞免疫,清除HBV转基因动物血循环中的HBsAg颗粒和HBV DNA。如果加入各种免疫调节细胞因子的基因,可以进一步提高HBV DNA疫苗的免疫效果,因此它不仅可作为预防性疫苗,也可作为治疗型疫苗。     

PCR—ELISA检测HBV DNA的研究

目的：建立一种敏感、特异的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测方法。方法：应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术（即PCR－ELISA技术）来检测血清中的HBV DNA。结果：应用PCR－ELISA技术能够检出许多PCR琼脂张胶电泳所检测不到的HBV DNA,大大地提高了检出率,而且,特异性强。结论：PCR－ELISA方法灵敏度高,行异性强,检测结果数据化,不受主观因素的影响。     

PCR检测血清HBV DNA

本文利用ＨＢＶ ＤＮＡ基因组ｐｒｅＣ和Ｃ区的一套引物,以ＰＣＲ法检测了２６例健康正常人血清和９５例免疫标志各异、临床症状不同的乙肝或可疑乙肝患者的血清,前者无１例检出ＨＢＶ ＤＮＡ,后者共检出的６６例血 清存在ＨＢＶ ＤＮＡ。该方法特异性强,适用于检测任一亚型的ＨＢＶ ＤＮＡ,一轮ＰＣＲ最低可检出０．１ｐｇ的ＨＢＶ ＤＮＡ。     

一种适宜微量全血检测HBV—DNA裂解液的评价

通过核裂解液与氯仿／酚处理法以及与另四个生产厂家的裂解液对指法全血处理法的比较,检测ＨＢＶ－ＤＮＡ的结果表明：该裂解液可更有效除去全血中对Ｔａｑ酶有抑制性作用的血卟啉、扩增结果与用血清作标本结果一致,表明指尖全血用这种裂解液处理完全替代血清标本用于ＨＢＶ－ＤＮＡ的ＰＣＲ检测。     

PCR技术用于HBV DNA检测的研究进展

ＰＣＲ技术自八十年代在美国问世以来,已成功地用于多种病原体的检测,八十年代末在美国成功的利用此技术对ＨＢＶ　ＤＮＡ进行了检测,我国在九十年代初也世开始了这方面的工作,并取得了成功,本文综合介绍国内外这方面的工作,并对一些具体的ＰＣＲ方法进行了详细的介绍,并对利用ＰＣＲ技术检测ＨＢＶ　ＤＮＡ时因实验设计及操作误差造成的负面影响进行了讨论。     

快速检测HBV DNA的环状介导等温DNA扩增法

环状介导等温DNA扩增（LAMP）技术是一种新的核酸扩增方法,它能够高特异性、高效、快速地进行核酸的扩增。利用LAMP法检测乙型肝炎病毒（HBV）,能够在等温条件下于1h内将少量的基因拷贝数扩增至10^9,在对65份临床标本的检测中显示了较高的特异性。与现有的PCR技术相比,LAMP法更加简便快速,且在等温条件下进行,不需要复杂的仪器设备,为临床检测乙肝病毒提供了一个快速筒便的新方法。     

乙型肝炎患者HBV复制水平的定量PCR研究

本文采用定量ＰＣＲ方法观察了慢性乙型肝炎患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的复制水平。结果表明在ＨＢｅＡｇ阳性患者血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率和水平显著高于ＨＢｅＡｇ阴性患者（Ｐ＜０．０１）;血清ＨＢＶ－ＤＮＡ水平的高低与ＡＬＴ异常情况未发现有相关性。     

克隆鸭乙型肝炎病毒DNA双体体内转染的研究

用一种含头尾相连DHBVDNA双体的质粒体内转染2日龄芙蓉鸭,大多数鸭（86％）产生了短暂病毒血症。血清DHBs／preSAg和DHBVDNA于转染后第9天出现,第12～14天达峰值,第28天时多数转阴;少数鸭的病毒血症可持续50天以上。转染鸭肝组织中也检测到复制中间型DHBVDNA的存在。用转染鸭病毒血症期的血清作磷钨酸负染电镜观察,找到了完整的DHBV病毒颗粒,并且用此血清腹腔注射1日龄鸭,60％的鸭被感染成功,证明体内转染后有生物活性的DHBV病毒颗粒的产生。该研究方法的建立．对于研究DHBV变异株．DHBV基因结构与功能的关系等,均有一定理论意义及应用价值。     

乙型肝炎病毒DNA在患者血清及肝组织中存在状态的研究

对29例肝炎,1例尸检肝组织和血清中乙型肝炎病毒的DNA(HBV DNA)进行了研究,发现HBsAg( )/HBeAg( )患者中,有9/17(52.94％)血清HBV DNA阳性;HBsAg( )/抗-HBe( )患者中,2/6(33.33％)也为阳性。从30例肝组织中提取DNA经琼脂糖电泳,Southern吸印转移及分子杂交试验结果表明,27例HBV DNA阳性,全部有游离型HBV DNA。27例中有5例经用标记pBR322探针杂交排除非特异杂交带后,在高分子量区有HBV DNA特异的杂交带,提示有HBV DNA整合。     

PCR-ELISA检测HBV DNA的研究

目的:建立一种敏感、特异的乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测方法。方法:应用PCR扩增技术和核酸杂交技术结合酶促显色技术(即PCRELISA技术)来检测血清中的HBVDNA。结果:应用PCRELISA技术能够检出许多PCR琼脂糖凝胶电泳所检测不到的HBVDNA,大大地提高了检出率,而且,特异性强。结论:PCRELISA方法灵敏度高,特异性强,检测结果数据化,不受主观因素的影响 。     

携带HBV包膜大蛋白DNA疫苗的减毒沙门菌在小鼠诱导免疫应答

探索一种简便、有效的乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫方法。将编码绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFPN1转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,灌胃饲服BALB/c小鼠,流式细胞术检测出小鼠脾细胞内表达的绿色荧光蛋白;构建编码HBV包膜大蛋白的DNA疫苗pCIS1S2S,分别以SL7207为载体的口服途径或直接肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应,结果表明两种免疫途径均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答,但口服途径诱导免疫应答的强度明显强于肌肉注射途径。口服携带HBV DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌可能代表一种简便、有效的治疗乙型肝炎的新方法。      

抗HBV与HCV免疫乳的实验免疫研究

确定重组HBV表面抗原和HCV核心抗原对奶牛的最适免疫剂量、免疫次数及间隔时间,观察牛奶中抗HBV与抗HCV的效价与消长规律。表达HBV表面抗原和HCV核心抗原的重组菌经IPTG诱导后,目的蛋白以包涵体形式存在。放大发酵工艺,菌体发酵密度达40g／L,目的蛋白表达量为26％～30％。将包涵体变性、复性后,测定蛋白含量,并用SDS-PAGE鉴定。采用不同的剂量和不同的抗原处理方法免疫奶山羊和奶牛,检测HBV抗体、HCV抗体、干扰素与白介素等细胞因子。免疫奶山羊羊奶中的HBV抗体效价最高为1：80,HCV抗体效价最高为1：20;6个月后,HBV抗体效价无明显下降,HCV抗体效价下降明显。对奶牛5个批次的免疫结果显示,免疫次数应多于3次,免疫剂量以每头牛300μg为宜,间隔时间以1个月为宜。免疫牛奶中HBV抗体的阳性率约为66．0％,抗体效价最高为1：160;HCV抗体阳性率约为17．0％,维持时间较短;孕牛比旺奶牛产生抗体的效价高。免疫牛奶中检测到了干扰素和白介素等细胞免疫活性因子。     

不同方法检测血清HBV DNA的比较研究

采用夹心斑点杂交法、PCR-EB定性及Amp-lisensor定量法对HBsAg与抗-HBs同时阳性、HBsAg阳性、抗-HBs阳性和HBsAg与抗-HBs均阴性的乙型肝炎病毒(HBV)感染者检测血清HBV DNA.结果三种方法的阳性率分别为29.1%、47.7%和80.2%;各组HBV DNA含量分别是106.13±1.86、106.08±1.82、104.12±1.40和105.07±1.21(拷贝/ml).结论是Amplisensor法检测HBV DNA具有更高的敏感性;抗-HBs阳性的HBV感染者血清中仍可检出HBV DNA.     

HBV基因型、基本核心启动子区双突变和肝细胞癌发生及临床病理特征的关系

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型、基本核心启动子(BCP)区双突变(简称BCP双突变)和肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)发生的关联,分析BCP双突变和HCC临床病理特征的关系。方法随机收集233例慢性HBV感染者的血清,其中80例为慢性乙型肝炎(CHB)患者、75例为LC患者、78例为HCC患者,并系统整理患者的常规检查和病理等资料。采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测BCP双突,用特异性引物多重PCR扩增确定HBV基因型。用SPSS 11.0分析结果。结果 HBV基因型结果均为B和C型,分别在CHB和LC组,CHB和HCC组间分布差异有统计学意义(P<0.05),在LC和HCC组间分布差异无统计学意义(P>0.05),感染C基因型与LC和HCC发生相关(分别OR=2.73,95%CI=1.29～5.82;OR=2.00,95%CI=0.98～4.09)。BCP双突变也分别在CHB和LC组,CHB和HCC组间分布差异有统计学意义(P<0.05),在LC和HCC组间分布差异无统计学意义(P>0.05),双突变与LC和HCC发生相关(分别OR=1.91,95%CI=0.96～3.82;OR=2.05,95%CI=1.04～4.06)。BCP双突变和伴肝硬化的HCC相关(P<0.05)。结论感染HBV C基因型、BCP双突变可能均是LC和HCC发生的危险因素,BCP双突变可作为LC和HCC早期预警生物标记物。     

不同干扰素应答慢性乙型肝炎患者的基因组DNA甲基化谱差异分析

α干扰素,包括长效干扰素——聚乙醇化α干扰素(PEG-IFNα),是临床用以治疗慢性乙型肝炎的首选药物。但干扰素治疗通常只能在有限的患者中获得完全应答。目前干扰素治疗应答相关指标预测的灵敏度与特异度远未令人满意,因此继续寻找潜在的与干扰素疗效预测相关的分子标记仍是一个十分有意义的工作。为探讨慢性乙型肝炎患者基因组DNA甲基化状态与干扰素治疗疗效的关系,本研究采用RocheNimbleGen人甲基化DNA免疫共沉淀-芯片(MeDIP-chip)技术,分析20例不同干扰素疗效慢性乙型肝炎患者的血浆基因组启动子甲基化谱差异,并利用MeDIP-定量聚合酶链反应(MeDIP-qPCR)检验部分基因启动子区域DNA甲基化的水平。结果显示,与快速应答组相比,无应答组中有588个基因启动子区甲基化水平存在显著差异(P0.05)。这些基因主要涉及多个信号通路,即钙离子信号通路、细胞周期调节通路、肝脏代谢相关通路等。MeDIP-qPCR验证与芯片结果的一致性超过80%。本研究为探讨差异甲基化基因在干扰素应答中的作用及发现潜在的预测干扰素疗效的血液分子标记奠定了基础。