腺病毒载体构建及在疫苗研制上的应用

痘苗病毒载体研究和应用虽多,但国际卫生组织(WHO)已宣布全球消灭天花可不再种痘,加之该病毒用于生物体后可以引起机体发生免疫排斥反应,限制了目的基因在生物体内长期有效的表达,也给重复接种带来困难,而且痘苗病毒对生物体还具有一定毒性作用,人类种痘偶尔产生严重副反应,从而限制了其使用范围。目前在改造腺病毒基因组方面已取得明显进展,证明腺病毒是基因工程疫苗的重要载体,倾向于以腺病毒为表达载体发展多价重组口服活疫苗,尤其在乙型肝炎和狂犬病疫苗研制上成效卓著,安全的腺病毒载体疫苗必将产生并成功地得到临床应用。本文着重从腺病毒载体构建,人和犬腺病毒载体重     

乙型肝炎病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及发展前景

人类腺病毒基因组Ｅ１区,Ｅ３区及介于Ｅ４区和右侧端插入性末端重复之间的区段存在插入位点,可供插入乙型肝炎病毒保护生免疫原基因,构建重组载体疫苗,本文就Ａｄ基因组分区段阐述了各类ＨＢＶ重组Ａｄ表达戴本构建的一般原则,并指出了辅助细胞依赖性缺陷型Ａｄ载体用作非复制性Ａｄ载体活疫苗的潜力及非缺陷型Ａｄ双表达载体用作复制性Ａｄ载体活疫苗的前景。     

CELO病毒载体在人类和动物疾病控制上的应用

CELO病毒的DNA长43．8kb,具有末端倒转重复序列(ITR),基因结构与人腺病毒的比较,无可识别的E1、E3和E4区,但存在可替代的新读码框。2个fiber基因是病毒毒力基因,表达2个不同的蛋白,在病毒复制扩散中起作用,缺失fiberl导致柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)的特异性转导作用消失,使CELO病毒只能感染禽类细胞,不能感染哺乳类动物细胞。在基因组的某些区段可以删除并插入外源基因不影响病毒复制。CELO病毒及其载体可在廉价的鸡胚中得到大量复制。CELO病毒的这些特性为其发展成新型基因工程载体提供了条件。插入表达外源基因制备疫苗成为可能,新型的无病毒基因的载体也可以应用ITR及一些调控元件、包装信号共同构建形成。CELO病毒与人腺病毒属于同一属,CELO病毒作为基因工程载体有同样的特性,并且具有种属特异性和安全性,在动物基因工程疫苗的研制方面有特殊而广阔的研究和应用前景。     

禽腺病毒江苏株（JS）复制非必需片段的确定

利用PCR方法从一株Ⅰ群禽腺病毒的分离物(FAVI-JS)中扩增出其基因组的两个末端L片段和r片段、ITR片段,并分别克隆进pGEM-T easy载体,然后将L片段、r片段和ITR片段同时克隆进pHC粘粒载体中,获得质粒pHC-FAVI-r-ITR-L,再在该克隆片段中插入增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因,获得转移质粒载体pFAVI-eGFP.将pFAVI-eGFP转染已被该野生型Ⅰ群禽腺病毒分离物感染了的鸡胚肾细胞进行同源重组,通过无限稀释法筛选重组病毒,结果获得了表达增强型绿色荧光蛋白的重组Ⅰ群禽腺病毒rFAVI-eGFP,证明位于基因组右末端r片段和ITR片段之间的位点为病毒复制非必需区,为禽腺病毒的重组基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

腺病毒载体及其在基因治疗研究中的应用

腺病毒载体在基因治疗研究中初露锋芒,引起关注,文章就腺病毒基因组的基本结构、腺病毒载体的类型及构建、重组腺病毒在基因治疗研究中的应用及其主要优、缺点等方面进行了较为全面的综述．     

隐球菌免疫相关的甘露糖受体MR重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 从巨噬细胞系RAW264.7基因组中扩增甘露糖受体(MR)基因,克隆至穿梭质粒后包装重组腺病毒,以进一步研究甘露糖受体MR基因对树突状细胞参与抗新生隐球菌免疫的影响.方法 采用PCR方法以及基因重组方法扩增并克隆巨噬细胞基因组中的MR基因,包装能表达MR蛋白的重组腺病毒.结果 从巨噬细胞基因组获得MR全基因,克隆至pShuttle-CMV载体,包装了MR的重组腺病毒AD-MR,并在HEK293细胞中获得了表达.结论 成功克隆巨噬细胞MR基因并构建了可表达MR基因的重组腺病毒载体,为进一步研究MR基因在树突状细胞参与新生隐球菌免疫中的作用奠定基础.     

鸡减蛋综合征病毒DNA的基因文库构建和酶切位点分析

腺病毒载体已经成为基因工程疫苗及癌症、遗传病基因治疗的重要工具。腺病毒可分为哺乳动物腺病毒和禽腺病毒,禽腺病毒包括20多个血清型,分别归属于三个群:Ⅰ群为传统的禽腺病毒(FAV),Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)等,Ⅲ群禽腺病毒为减蛋综合征病毒(EDSV)。这些病毒广泛地存在于多种禽类的呼吸道、消化道,大多呈显性或不显性感染。以禽类腺病毒为载体表达禽类重要病原的保护性抗原基因,构建多价(联)活载体基因工程疫苗,有其重要特点:腺病毒的某些毒株可以在禽体     

一种辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建及其在小鼠体内的应用

腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了目的基因在体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体ＨＡｄＩ－ｈＦＶＩＩ。该载体去除了病毒基因组的ｌ３、Ｌ１、Ｌ２、ＶＡＩ－ＶＡＩ、ｐＴＰ等基因序列。在第一代重组病毒ＡｄＩ－ｈＦＶＩＩ辅助下,能在２９３细胞包装和扩增。经氯化铯梯度超速离心后,能与辅助病毒有效分离。小鼠体内研究表明,该载体能在体内高效转移和表达ｈＦＶＩＩ基因。与笫一代腺病毒载体比较,外源基因表达稳定性明显提高,提示该载体在体内具有较低的免疫原性。     

痘病毒载体的应用

简单介绍痘病毒载体的实际应用。其原理是通过同源重组将外源DNA插入到痘病毒基因组的非实质区域,表达的外源蛋白能正确地进行修饰,并有较高的表达效率,可刺激机体产生免疫应答。痘病毒载体作为基因工程中的重要工具,其应用极其广泛,已成功地表达了来源于植物、动物,乃至人类的许多基因。     

一种辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建及其在小鼠体内 …

腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了大体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体ＨＡｄＩ－ｈＦＶＩＩＩ。该载体去除了病毒基因组的ｌ３、Ｌ１、Ｌ２、ＶＡＩＶＡＩＩ、ｐＴＰ等基因序列。在第一代重组病毒ＡｄＩ－ｈＦＶＩＩＩ辅助下,能在２９３细胞包装和扩增。经氯化     

人类腺病毒受体的研究进展

腺病毒受体的研究近十几年来得到迅速发展,人们对腺病毒受体的研究兴趣主要源于使用腺病毒载体所进行的基因治疗.随着多个腺病毒受体相继被发现和鉴定(表1),对腺病毒感染细胞的过程有了进一步的认识和理解.例如,腺病毒5型(Ad5)已被用作基因治疗的载体,但不能有效地感染受体低表达的细胞[1].人们通过修饰腺病毒载体中与受体结合的相应部位,提高基因传递的效率,使腺病毒载体在基因治疗中的作用不断完善.本文就已经鉴定的腺病毒受体和相应配体在腺病毒进入细胞时所发挥的作用加以综述.     

腺病毒载体在基因治疗和疫苗研究中的应用

自从二十世纪五十年代开始认识腺病毒（Adenovirus）以来,对腺病毒的生物学和免疫学特征已经有比较多的认识。腺病毒科包括禽腺病毒属（Aviadenovius）和哺乳动物腺病毒（Mastadenov irus）两个属。除人腺病毒以外,一些哺乳动物的腺病毒和禽腺病毒也成为基因治疗和载体疫苗研究的热点,如猪腺病毒3型（PAV-3）、牛腺病毒3型（BAV-3）、绵羊腺病毒（Ovine adenovirus,OAV）、禽腺病毒（Aviadenovirus）、犬腺病毒（Canine adeno virus,CAV）和黑猩猩腺病毒（Chimpanzee adenovirus）。不同种属的腺病毒虽然基因组序列完全不同,但其结构和功能却非常相似,而且各型腺病毒之间很少有交叉免疫反应,这就为利用这些腺病毒研制基因治疗载体和活载体疫苗提供了丰富的材料。近年来的研究也发现,如果利用一种腺病毒载体来进行重复免疫,宿主针对腺病毒载体蛋白的免疫反应比较强大,造成转基因表达时间缩短,重复免疫的效果较差,换用不同的病毒载体,则可以回避这种免疫反应,提高转基因的表达时间和保护性免疫反应。腺病毒可以感染很多分裂期或静止期细胞,即使在一些高度分化的组织细胞中也可增殖,如可有效的感染肌肉组织、心、肺和脑组织,并能高效的复制、表达其基因产物,因此腺病毒成为基因治疗和活病毒载体疫苗研究的首选工具。     

动物腺病毒用作基因治疗载体的研究进展

动物腺病毒具有与人腺病毒类似的基因组结构,近年来,通过缺失部分病毒基因并建立相应的互补细胞系,已构建成功大,绵羊及牛腺病毒栽体,这些新型动物腺病毒载体即可将外源基因转移到人体细胞内表达,本身又不能在其中复制繁殖,具有较高的安全性,人体内地们的免疫应答,因此可望替代人腺痍和为基因治疗及基因免疫的载体。     

炭疽杆菌保护性抗原(PA)重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性.从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA.PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA.vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western- blot检测表明PA在293细胞中得到表达.重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为12800.该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础.     

炭疽杆菌保护性抗原（PA）重组腺病毒的构建及免疫效果分析

探讨利用腺病毒载体作为炭疽杆菌基因工程疫苗载体的可行性。从载体pcDNA3.1-PA上PCR扩增PA片断,将该片断克隆入质粒pAdTrack-CMV,得到阳性克隆pAdTrack-PA。PmeI线性化的阳性克隆转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组后得到重组腺病毒vAd-PA。vAd-PA经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western-blot检测表明PA在293细胞中得到表达。重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法检测血清中产生了特异性抗体,抗体滴度计算几何均数为1:2800。该研究为进一步研究以腺病毒为活载体的疫苗奠定了基础。     

杆状病毒载体及其在昆虫细胞中表达外源基因的研究进展

本文介绍了杆状病毒载体在昆虫细胞中表达外源基因的基本策略和发展趋势。杆状病毒载体系统近年来已被人们广泛用来表达人类、动物和植物等的一些重要蛋白质分子,在医学、农业等领域的基因工程研究中发挥了越来越大的作用。杆状病毒载体系统表达外源基因的效率高,表达产物的结构和活性与天然产物一致,为当今基因工程研究中最有发展前途的病毒载体表达系统。     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

表达PRRSV M蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株的M蛋白基因,将其克隆重组到人血清5型腺病毒载体中,转染293细胞,制备重组腺病毒rAd-M.RT-PCR和IFA方法鉴定,结果表明rAd-M可表达M基因的mRNA和M蛋白.纯化的rAd-M重组腺病毒经293细胞连续传25代,滴度稳定为107.8TCID50/mL.动物免疫试验结果表明,该重组腺病毒rAd M能够刺激机体产生PRRSV的特异性抗体免疫和细胞免疫应答反应,从而为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.     

H5N1禽流感病毒HA和NA基因重组腺病毒共表达载体的构建

利用口蹄疫病毒(FMDV)2A蛋白具有自我裂解的功能,将其作为连接肽构建携带有H5N1亚型AIVHA和NA基因的重组腺病毒表达载体,进而为AIV基因工程疫苗的开发以及相关诊断试剂的开发提供依据。采用融合PCR的方法扩增出含有H5N1 AIV HA-2A-NA的基因,定向插入pAdtrack-CMV腺病毒穿梭质粒中,含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在基因工程菌BJ5183中进行同源重组,获得腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA,将pAdeasyd-H5经PacI线性化后转染HEK293细胞株包装出含有HA-2A-NA基因的腺病毒pAd-HA-2A-NA。结果表明,构建的含有目的基因的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-HA-2A-NA和含有目的基因的腺病毒质粒pAdeasy-HA-2A-NA经PCR、双酶切及核苷酸测序测定无误。线性化后的pAdeasy-HA-2A-NA转染HEK293细胞包装成功获得腺病毒pAd-HA-2A-NA载体,经绿色荧光蛋白和RT-PCR分析证实,目的基因在该细胞中成功表达。本试验构建的含有AIV H5N1亚型HA-2A-NA基因的重组腺病毒表达载体,将为进一步研究开发基因工程疫苗提供病毒模型。     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.