大乳头水螅基盘再生进程中过氧化物酶的表达

目的观察大乳头水螅(Hydra magnipapillata)基盘再生进程中基盘过氧化物酶的表达情况,探讨水螅基盘过氧化物酶的生理作用。方法通过ABTS细胞化学染色法显示水螅基盘过氧化物酶的表达。结果水螅基盘再生20h后其基盘过氧化物酶开始出现少量表达,其后过氧化物酶表达量逐渐增加;基盘再生52h后该酶表达量趋于稳定。过氧化物酶仅在基盘周边区域外胚层中表达,而在基盘中央区域(反口孔)外胚层中无表达。结论水螅基盘再生进程中过氧化物酶的表达量逐渐增加直接反映了基盘再生时细胞分化过程,基盘表达的过氧化物酶可能在维持基盘结构的稳定上起一定的作用。     

水螅营养积累对基盘组织更新进程的影响

目的观察大乳头水螅（Hydra magnipapillata ）基盘组织更新进程,探讨水螅营养积累对基盘组织更新进程的影响。方法设定水螅喂食频率梯度（代表不同的营养积累水平）,记录和观察喂食频率对水螅更新基盘组织进程的影响。通过ABTS细胞化学染色法检测水螅基盘分子标志物过氧化物酶的表达,观察水螅老基盘组织脱落后水螅体主体新生基盘组织的再生过程。结果喂食频率对水螅更新基盘组织进程有明显的影响。水螅基盘组织更新的标准过程如下;在一定的喂食频率下培养水螅,水螅体出芽区逐渐有芽体产生,随后在出芽区和基盘之间靠近芽体的位置出现缢痕,最后水螅体在缢痕处断裂为水螅体主体和老基盘组织两部分。缢痕断裂后对水螅体主体保持既定的喂食频率,其伤口能愈合但不能再生出新的基盘组织;对其降低喂食频率直至其伤口上方的芽体全部脱落后伤口处重新启动新生基盘组织的再生进程。另外,脱落的老基盘组织有两种不同的命运,即大部分老基盘组织不能发育成正常水螅体、最终解体;而小部分的老基盘组织能发育成正常的水螅体。结论水螅营养积累可能促进基盘组织更新进程,靠近断裂伤口处的芽体能抑制水螅体主体新生基盘的再生进程。     

水螅异常极性体轴的形成及矫正进程的观察

目的:如何建立和维持体轴是一个基本的发育生物学问题,而淡水水螅是适合进行形态发生和个体发育调控机制研究的重要模式生物。本文观察了大乳头水螅异常极性体轴的形成及矫正进程,初步探讨水螅极性体轴的维持和调控机制。方法:先切取水螅的整个头部,再获得带二根触手的口区组织。通过ABTS细胞化学染色法检测水螅基盘分子标志物过氧化物酶的表达,判别水螅基盘组织(水螅足区的末端)是否形成。结果:从40块口区组织再生得到的水螅个体中有1例极性体轴发育异常的个体,其身体两端均发育成头区,且两端的头区均具有捕食能力。随后水螅其中一端头区的触手逐渐萎缩、退化,最终该端头区转化成具有吸附能力的基盘组织。结论:水螅组织的再生涉及极性体轴的重建,而一些特殊因素可能造成临时性的水螅极性体轴调控紊乱。本研究表明水螅具备自我矫正异常极性体轴的能力。另外,本研究结果显示水螅触手可以萎缩直至退化,该现象涉及的细胞学过程可能是非常复杂的,有可能涉及到触手细胞的凋亡转化过程,也可能是触手的高度分化细胞仍然具备去分化能力、去分化后再转移到身体其他地方,其具体机制值得进一步探究。     

水螅芽体发育与头部再生进程间的相互作用

目的观察具有单个芽体的大乳头水螅(Hydra magnipapillata)头部再生进程,探讨水螅头部结构的再生进程与芽体发育过程之间可能存在的相互作用。方法选取具有单个年幼芽体的水螅体,在水螅母体上紧贴芽体着生部位的上方进行切除手术,观察母体头部再生进程。通过ABTS细胞化学染色法检测水螅基盘分子标志物过氧化物酶的表达,观察水螅芽体基盘与母体间的结构联系。结果水螅母体伤口在手术后2h内愈合。随着再生时间的延长,出现两种不同命运的芽体发育方式。一种情况是水螅芽体基盘紧贴母体手术切口,芽体发育成熟后可正常脱离母体;在芽体脱离母体前母体头部再生进程被抑制,在芽体脱落后母体头部再生进程重新启动、且在其后48h内母体头部再生完成。另一种情况是水螅芽体基盘组织与母体手术切口不产生结构联系而向外突出生长,母体头部再生进程完全停止,芽体胃区与母体相连且芽体发育成熟后不脱离母体。结论靠近水螅母体手术伤口的年幼芽体能延迟或阻断母体头部的再生进程,而手术切口也可能干扰了发育成熟的芽体与母体脱离的正常机制。     

植物细胞表面蛋白的研究——Ⅳ 烟草细胞表面蛋白的盐溶性组分是部分质膜蛋白组分的外延

用EDTA和某些去垢剂在有0.15MNaCl存在的条件下提取烟草细胞表面蛋白,认为含有5％正丁醇、10 mM Tris-HC1、0.15 MNaCl和0.1mM EDTA的溶液(pH 7.5,B-TBSE)是比SDS-TBSE更为理想的溶剂。过氧化物酶、酯酶、磷酸酶和ATP酶可直接进行测定。溶液中亚丁醇和EDTA的浓度对ATP酶无明显的抑制作用。 TCSP中的盐溶性组分(TSP)可以用生理盐水直接从细胞表面洗脱。质壁分离时TSP大部分都吸附在墨表面,休克时有过氧化物酶和部分ATP酶释放出来。在高渗条件下吸附在壁表面的酶,大部分部可用1％胆酸钠增溶。除上述盐水可洗脱的酶以外,细胞壁中尚有一部分可用1％Triton X-100、1 MNaC1洗脱的和碱溶性的蛋白(ASP)结合的过氧化物酶。当细胞由对数生长期中期进入后期时,TSP的过氧化物酶活性增加而酯酶活性下降。实验表明TSP是部分质膜蛋白组分的外延。 1 mMEDTA、5 mMMgCl_2或含有1mMEDTA的5％正丁醇都不能从细胞表面洗下ATP酶。但预先用E DTA、MgCl_2或含有EDTA的正丁醇洗涤细胞,则可阻碍或促进ATP酶的分离。而且EDTA的阻碍作用可被MgCl_2抵消。     

杂色鲍足的显微与超微结构

杂色鲍（Haliotis diversicolor）隶属软体动物门、腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目、鲍科、鲍属。鲍的足是柔韧性很好的器官,它具有运动、支持、感觉与辅助捕获功能,是鲍生活中匍匐和吸附岩石等固着物的重要部位,因其首先接触环境而成为脓疱病、裂壳病、弧菌病等病病原体的主要侵袭部位,这些病可造成十分严重的鲍死亡现象。国内学者对鲍足的研究文献较少,仅有关于皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）足的组织学（崔龙波等,1997）及皱纹盘鲍足的粘液细胞的片断研究（王宜艳等,2004）报道。     

甲壳动物血液凝固的分子机制

甲壳动物的防御机制完全依赖于非特异性免疫系统,血淋巴的凝固在宿主防御和阻止血淋巴渗漏中起重要的作用.甲壳动物的凝固酶的激活有两种独立的方式.在鳌虾中,依赖于Ca2+的转谷氨酰胺酶催化可溶性的凝固蛋白原转变成共价交联的凝固蛋白多聚物,不需要蛋白裂解反应.相反,在鲎中,位于淋巴细胞中凝固反应的所有因子都在受到脂多糖激活分泌到胞外,一系列的蛋白裂解反应使得凝固蛋白原转变成凝固蛋白,凝固蛋白间通过非共价的交联结合,而有转谷氨酰胺酶催化的凝固蛋白和淋巴细胞表面proxin间的结合则更加稳定了凝固蛋白反应.     

监测活细胞中诱导激活的Rac、Cdc42信号转导通路的FRET单分子探针

Rho家族鸟苷三磷酸酶,包括Rac1和Cdc42等．参与调节细胞形态、细胞迁移、转录激活和基因表达等一系列细胞过程。根据FRET（Fluorescent resonance energy transfer）技术原理,构建了包含红色荧光蛋白dsRed1与青色荧光蛋白ECFP的全长cDNA．效应分子Pak1或N—WASP的GTP酶联结区域．信号分子Rac1或Cdc42的全长cDNA的几种单分子探针。转染NIH3T3或Hela细胞,以胰岛素、缓激肽为诱导剂,分别激活Rac1、Cdc42信号转导通路。离体荧光光谱检测表明．在两种转染动物细胞中均产生了FRET现象。不同信号转导通路的FRET效率,在诱导激活5min后,均达到最高值,但增加幅度有显著差异。随着诱导时间的延长,FRET效率下降,但下降速率在不同信号转导通路间差异显著。Rac1、Cdc42激活试验证实．诱导激活的转染细胞中,Rac1、Cdc42均处于激活状态（GTP—bound）,其在不同诱导时间的相对激活程度与FRET效率表现相同。诱导激活的Rac1、Cdc42信号转导通路,分别导致了转染活细胞中片状伪足、线状伪足的产生。这表明,采用这些单分子探针,可直接监测激活的信号转导通路,在活细胞中的3D时空分布变化图像及其产生的细胞学效应。采用这些单分子探针．分析、判断了一些调节蛋白对Rac1、Cdc42的GEF或GAP特性。从而提供一种可大大简化现有的鉴定待测蛋白分子的方法。     

戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究

E.coli中表达的HEV衣壳蛋白片段P239(aa368~606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性,较好地模拟了天然HEV病毒颗粒的表面空间结构。利用P239吸附HepG2细胞的模型来模拟HEV对宿主细胞的吸附,多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性。P239与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性。对阻断P239吸附的线性单抗进行定位,初步确定了P239与细胞相互作用的区域:ORF2上的aa423~443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近,或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位。此本研究为进一步研究HEV与宿主细胞的相互作用提供一定的线索。     

蛋白质表面疏水性的研究

用Ｐｈｅｎｙｌ－ＳｕｐｅｒｏｓｅＨＲ５／５疏水柱在ＦＰＬＣ仪上测定了一些蛋白的表面疏水性。在被测量的蛋白样品中,细胞色素Ｃ的亲水性最强,胰凝乳蛋白酶的疏水性最强。说明蛋白质的疏水性与其表面性质密切相关,而与蛋白质的分子量、疏水残基总数并不直接相关;去辅基细胞色素Ｃ和Ｃ端缩短的金黄色葡萄球菌核酸酶与天然态比较疏水性变化很大。疏水柱层析还用于监测在低浓度胍的作用下蛋白质的构象变化。以Ｎ－乙酰酪氨酸为模型化合物探测盐酸胍对疏水柱结合能力的影响,在０４Ｍ胍存在时,Ｎ－乙酰酪氨酸在疏水柱上的结合能力略有减弱,但核糖核酸酶Ａ的变化较大,表明胍引起的蛋白质的微小构象变化有效地引起其表面性质的变化;在０．１—０．３Ｍ盐酸胍存在时,甘油醛－３－磷酸脱氢酶表面疏水性明显增大,并伴随聚合态的出现。说明在低胍作用下,酶分子发生的构象变化,导致天然态内埋疏水面的暴露,暴露的疏水面间的相互作用是形成聚合的主要原因。     

病毒受体的研究方法

1概况 病毒受体可以定义为位于宿主细胞表面能够被病毒吸附蛋白识别并与之结合,从而引起病毒感染的分子复合物,其化学本质是糖蛋白、蛋白聚糖、脂类或糖脂,大多数属于蛋白质.病毒受体可以是单体也可以是多分子复合物,具有特异性、高亲和性、饱和性、结合位点及靶细胞部位的有限性以及独特的生物学活性等[1].病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的主要决定因素,也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素之一.     

酵母表面展示-酶联免疫吸附测定法的建立

以表面展示人源蛋白酶体α亚基6蛋白的重组酵母细胞,结合酶联吸附免疫原理检测技术,以表面展示有人源蛋白酶体α亚基6(proteasome subunit alpha6,PSα6)的重组酵母细胞及其对应的单克隆抗体3D7D12D为研究对象,建立酵母酶联免疫吸附(yeast-ELISA)检测技术,应用于检测小鼠单克隆抗体及单抗效价.应用该方法最佳酵母浓度为0.50A600;测得单抗效价为1∶5×105,与常规ELISA效价接近;交叉试验和阻断试验表明该方法特异性强;同时该方法可用于检测抗血清.结果表明,yeast-ELISA可直接应用于检测单抗,测得效价与常规抗原包被间接ELISA具有良好一致性,特异性好,无交叉反应性.     

金鱼早期仔鱼体表的电镜观察

应用扫描和透射电镜技术对金鱼(Carassius auratus)孵出1 d3、d9、d龄仔鱼的体表进行了观察。仔鱼的上皮细胞呈扁平、多边形,彼此之间由增厚的边缘嵴状突紧密连接,细胞向内凹陷的表面有指纹状嵴突。孵出3 d的仔鱼体表两侧各有一列间隔有序呈丘状突起的味蕾,外被单层上皮细胞,味孔处有一根粗圆的感觉毛。粘液细胞出现在仔鱼头部、腹部、体侧的表皮上,并开口于多个相邻上皮细胞间的连接处。粘液细胞胞质比例大,内含丰富、平行排列的粗面内质网,旁边有大量大小不一、内含物液化状、近圆形的粘原颗粒。9 d后仔鱼体表完全被粘液覆盖,初步建立了以粘液细胞为基础的防病和抗病机制,以机械和化学感觉为主的Ⅰ型味蕾觅食方式。     

脂滴包被蛋白(perilipin)调控脂肪分解

脂滴包被蛋白（perilipin）包被在脂肪细胞和甾体生成细胞脂滴表面。基础状态下perilipin可减少甘油三酯水解,使其贮备增加;脂肪分解时磷酸化的perilipin能促进甘油三酯水解,而且该蛋白对激素敏感脂酶从胞浆向脂滴转位是必需的。据推测,perilipin可能在脂肪分解调控中起到“分子开关”的作用。蛋白激酶A（PKA）、细胞外信号调节激酶（ERK）等信号转导通路参与了脂肪分解。肿瘤坏死因子仅（TNFα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAγ）激动剂、瘦素（leptin）均可以影响perilipin的表达。新近研究表明,perilipin可通过蛋白酶体途径来调节其蛋白量的表达。脂肪分解调控中的关键蛋白perilipin可以和2型糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等多种代谢性疾病及心血管疾病联系起来。     

病毒受体的研究方法

1概况病毒受体可以定义为位于宿主细胞表面能够被病毒吸附蛋白识别并与之结合,从而引起病毒感染的分子复合物,其化学本质是糖蛋白、蛋白聚糖、脂类或糖脂,大多数属于蛋白质。病毒受体可以是单体也可以是多分子复合物,具有特异性、高亲和性、饱和性、结合位点及靶细胞部位的有限性以及独特的生物学活性等[1]。病毒受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的主要决定因素,也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素之一。研究病毒受体的特性及其功能对于从分子水平阐明病毒感染与免疫的机制,深刻理解病毒与宿主细胞的相互关系,研制更有效的病毒…     

药物分子伴侣: 蛋白质折叠运输缺陷的新疗法

大量遗传性疾病的发生是由于基因突变引起蛋白质错误折叠而不能运输到作用位点,从而导致功能缺陷．近年来兴起的药物分子伴侣是恢复蛋白质折叠运输缺陷的新疗法,这类化合物一般为目的蛋白的底物类似物、受体配基或酶抑制剂等化学小分子,具细胞通透性,能在内质网中特异性识别并结合突变蛋白,校正并稳定其正确构象,协助其运输到正确位点,直接恢复突变蛋白功能,可治疗各种南蛋白质折叠运输缺陷导致的内分泌及代谢疾病．目前已报道的由药物分子伴侣恢复功能的突变蛋白主要为质膜蛋白及细胞器蛋白,如ATP结合盒转运蛋白、G-蛋白耦联受体及溶酶体酶等．大量的细胞及动物实验结果显示了药物分子伴侣的临床应用前景广阔,目前已有一例临床实验获得了成功．     

利用荧光蛋白标记西瓜枯萎病菌的过氧化物酶体及细胞核

西瓜枯萎病是一种世界范围的西瓜毁灭性病害,其病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)。研究病原菌生长发育和侵染的机制是解决病害的根本途径。利用荧光蛋白对细胞或细胞器进行标记,是病原菌研究中的重要方法。该研究利用绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白对FON的细胞核和过氧化物酶体进行了荧光标记。通过农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,AtMT),该文将3种不同的荧光定位载体分别导入FON,获得了细胞核红色荧光标记的转化子(潮霉素抗性,含mCherry-H2B融合蛋白),以及过氧化物酶体绿色(潮霉素抗性,含GFP-PTS1融合蛋白)和红色(潮霉素抗性,含DsRED-PTS1融合蛋白)荧光标记的转化子各1种。在标记细胞核的菌株中,菌丝、孢子都可见明亮、圆形的红色荧光点,荧光点与DAPI染色标记的细胞核区域完全重合。在过氧化物酶体标记的菌株中,菌丝、孢子中可见明亮的红色或绿色荧光成小点状分布,符合过氧化物酶体的分布特征,而且在脂类物质诱导的条件下,荧光点的数量明显增加。此外,该文还利用细胞壁荧光染色剂卡氏白对3种荧光蛋白标记菌株进行染色。结果显示,卡氏白染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光在FON中互不干扰。转化子继代培养和初步分析表明,其表型与野生型无差异,菌株继代后荧光表达稳定、定位明显。该结果为进一步研究FON细胞器动态、生长发育与致病分子机制提供了方法和工具。     

登革2型病毒结合血管内皮细胞分子机制的初步研究

以ECV304细胞为对象分析登革病毒感染血管内皮细胞的机制.2型登革病毒(DEN2)吸附后微量蚀斑法测定ECV304细胞上清释放的病毒滴度,证实该细胞对DEN2感染有一定的敏感性.机械刮取或胰蛋白酶消化法收集ECV304细胞分离膜蛋白,SDS-PAGE见胰酶处理样品缺失一43 kDa的膜蛋白.将ECV304细胞膜蛋白与35S-Met标记的DEN2进行病毒重叠蛋白结合试验(VOPBA),有29、34和43 kDa的3种膜蛋白可与DV结合,其中29 kDa的蛋白对胰酶耐受.培养的ECV304细胞中加入重组E蛋白(rEgp)对DEN2吸附进行阻断试验,微量蚀斑法与间接免疫荧光表明rEgp抑制DEN2感染该细胞.VOPBA中rEgp可阻断病毒与细胞膜蛋白的结合.结果表明ECV304细胞表面可能存在29、34、43 kDa的3种与DEN2结合的相关蛋白,DEN2 E蛋白可直接介导DV感染血管内皮细胞.     

广东四片藻鞭毛器的亚微结构和囊壳的形成

本文详细研究了1种海生4条鞭毛的单胞绿藻——广东四片藻鞭毛器的亚微结构和囊壳的形成。4条鞭毛着生于细胞前端凹陷的基部,鞭毛表面覆盖2层鳞片;基体呈纵向平行的“Z”字形排列;具纹纤维连接内外径向排列的两个基体;4个片层状的卵形盘(或称半桥粒(halfdesmosome))微管和纤维物质构成的复合体将鞭毛器和根丝体固着在质膜和囊壳上。根丝体通过两束交叉的微管带与两个邻近的外侧基体相连接。这种连接方式与其它已研究过的四片藻是不同的。囊壳的形成开始于内膜系统,特别是高尔基体。纤维丛和电子密集颗粒在其中合成、修饰,同时由高尔基体衍生的小泡转移到原生质体表面特定的区域,然后经若干步骤接合成完整的囊壳。这个区域与蛋白核的位置相关,表明聚合星状颗粒酶是在蛋白核位点制造或释放的,同时分泌到细胞外。囊壳沿边生长组装与细胞质发育产生特征性的前端鞭毛凹陷同时发生。     

灰葡萄孢菌过氧化物酶体及细胞核的荧光蛋白标记

【目的】对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的细胞核和过氧化物酶体进行荧光蛋白标记,为研究其生长发育和侵染过程中细胞结构和细胞器动态提供基础。【方法】以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(DsRED、mCherry)为报告基因,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,AtMT)将3种荧光蛋白标记载体分别导入灰葡萄孢菌标准菌株B05.10;通过PCR检测及荧光观察筛选和验证转化子,并进行单孢纯化;利用共聚焦显微镜记录细胞器荧光定位情况。【结果】获得了过氧化物酶体或细胞核稳定表达红、绿色荧光的重组单孢菌株,PCR验证表明标记基因成功整合入转化子基因组。在标记细胞核的菌株中,菌丝和孢子中可见多个明亮、圆形的荧光点,与DAPI染色共定位。标记过氧化物酶体的菌株中,菌丝和孢子中可见小点状绿色或红色荧光,在脂类物质诱导下荧光点数量明显增加,符合过氧化物酶体分布及动态特征。细胞壁染色结果显示,细胞壁染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光互不干扰,标记效果良好。【结论】获得了理想的过氧化物酶体或细胞核荧光标记的灰葡萄孢菌菌株,为研究其细胞器动态以及生长发育与致病分子机制提供了参考和材料。