河北地区临床实验室丝状真菌分离鉴定情况分析

目的开展一项由河北地区多所医院参与的临床实验室丝状真菌检测研究,促进实验室丝状真菌检测能力提升。方法共收集丝状真菌菌株,采用沙堡弱培养基和乳酸酚棉兰染色直接镜检进行菌种常规鉴定;中心实验室采用Vitek MS质谱进行复核鉴定,对MS不能有效鉴定的菌种进行核糖体DNA内转录间隔区ITS和/或钙调蛋白CaM测序分析。结果参与研究的15家三级医院2016～2017年共收集到丝状真菌225株。其中烟曲霉133株(59.11%)、黄曲霉/米曲霉28株(12.44%)、黑曲霉复合群18株(8.00%)、聚多曲霉6株(2.67%)、构巢曲霉6株(2.67%)、其他丝状真菌34株(15.11%)。样本类型包括下呼吸道痰标本203株(90.22%),耳道分泌物10株(4.44%),肺泡灌洗液4株(1.78%),其他样本8株(3.56%)。菌株鉴定正确率(148/225)65.78%,错误率(77/225)34.22%。结论丝状真菌感染中最常见的是曲霉菌属,主要以烟曲霉菌、黄曲霉菌和黑曲霉菌为主。传统的鉴定方法错误率高达30%以上,采用微生物质谱鉴定结合ITS/CaM区测序方法可以有效提高丝状真菌的鉴定正确率,为临床丝状真菌的治疗提供病原学依据。     

潞酒酒窖壁及酒缸上可培养真菌的分离和鉴定

采用察氏培养基对山西省长治市潞酒有限公司地下酒窖墙壁及酒缸外壁上采集的灰黑色霉状物进行分离纯化以获得真菌纯培养物,然后用扫描电镜和乳酸石炭酸棉蓝染色法在显微镜下观察纯培养物的菌丝体,再利用18S rDNA序列、β-tubulin微管蛋白基因(BenA)序列、Calmodulin钙调蛋白基因(CaM)序列分析技术分别对分离的纯培养物进行分子水平的鉴定并构建系统发育树。共分离到3株可培养真菌,分别是LJB-1、LJ3-2和LJ5-2。其中菌株LJB-1鉴定为地窖无孢霉Racodium cellare,该种在国内未见报道,属于国内新记录种;菌株LJ3-2和LJ5-2分别鉴定为小刺青霉Penicillium spinulosum和产黄青霉Penicillium chrysogenum,这两个种在酒窖菌中鲜见报道。     

日耳曼曲霉(Aspergillus germanicus)—曲霉属焦曲霉组一个我国新记录种

【目的】鉴定并报道我国一个曲霉新纪录种,即日耳曼曲霉。【方法】采用形态学性状及钙调蛋白和β-微管蛋白基因部分序列及核糖体DNA ITS1-5.8S-ITS2序列进行多相系统分类学分析。【结果】根据与日耳曼曲霉Aspergillus germanicus模式菌株CBS 123887的形态学和分子性状的比较分析,两株分离自中国山东泰山地区土壤的曲霉菌(AS3.15303和AS3.15304)被鉴定为日耳曼曲霉A.germanicus。【结论】参考我国迄今已报道的曲霉物种,确定日耳曼曲霉A.germanicus是曲霉属焦曲霉组的一个我国新记录种。     

口腔念珠菌基因多态性检测

目的检测正常人群口腔念珠菌基因型,以了解口腔念珠菌基因多态性。方法采集162例正常人群口腔样本,用念珠菌显色培养基(CHROM agar)进行菌种分离培养鉴定,用玉米Tween80培养基进行真菌孢子形态学检查鉴定,随机抽取45个菌株样本进行内含子转录间隔区(internal transcribed spacer region,ITS)序列检测,并比对同源性,建立进化树,观察菌株进化分支情况。结果分离培养出念珠菌菌株57株(57/162,35.2%),其中白色念珠菌(Candida albicans)36株(36/57,63.1%)。进行ITS序列检测的45个菌株申请GenBank序列注册号为FJ697166-GQ280292。结论正常人群口腔念珠菌基因具有多态性。     

一株甲基对硫磷降解菌——米曲霉JMUPMD-2的分离与鉴定

对一株新分离的、能以甲基对硫磷为唯一磷源生长的菌株——JMUPMD-2利用形态观察和rDNA ITS序列分析对JMUPMD-2进行鉴定; 用气相色谱法检测培养过程中甲基对硫磷浓度的变化, 确定甲基对硫磷降解速率。该菌株的rDNA ITS序列与米曲霉 (Aspergillus oryzae)的同源性为99%, 菌落形态和显微形态都与米曲霉特征相符, 因此鉴定为米曲霉; 以350 μg/L甲基对硫磷为唯一磷源和350 μg/L甲基对硫磷及1 g/L K2HPO4组成的混合磷源分别培养该菌株, 200 h后的分解量分别为189 μg/L及28 μg/L。该菌株的胞内提取液具有明显的甲基对硫磷降解酶活性。     

口腔黏膜真菌鉴定方法的比较

比较常见用于黏膜真菌菌种鉴别的多种方法,探寻最佳的鉴别方法。采集230例普通人群口腔黏膜样本,分别用玉米吐温-80培养观察厚膜孢子法、糖发酵生化反应法、CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法、ITS基因的PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性)法、ITS测序菌种鉴定法,鉴别真菌各菌株。结果显示:有56例菌株至少通过1种方法检出真菌;玉米吐温-80分离培养假丝酵母菌37株;50例菌株ITS基因测序共鉴定出8个菌种,白假丝酵母菌(C.albicans)29株,近平滑假丝酵母菌(C.parapsilosis)10株,热带假丝酵母菌(C.tropicalis)5株,Candida metapsilosis 1株,Lodderomyces elongisporus 1株,克柔假丝酵母菌(Candida krusei)1株,乙醇假丝酵母菌(C.ethanolica)1株,季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)2株;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法鉴定出3种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌;PCR-RFLP法检出5种菌株,分别是白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、季也蒙毕赤酵母菌、克柔假丝酵母菌,与基因的测序鉴定一致率为91%;糖发酵生化反应法阳性标本占被检出真菌例数的46.4%(26/56)。结果表明:ITS基因的测序法可以准确鉴定真菌各个菌种;PCR-RFLP法能鉴定常见的菌种,但操作繁琐;CHROMagar假丝酵母菌显色培养基法能快速准确鉴别3种常见假丝酵母菌菌种;玉米吐温-80可以准确培养鉴别白假丝酵母菌;糖发酵生化反应法,缺乏足够的敏感度和特异性,难以准确鉴别各个菌种。     

获得性免疫缺陷综合征患者的新生隐球菌基因多态性研究

本文旨在调查2003 年1 月― 2007 年12 月分离自上海地区获得性免疫缺陷综合征( AIDS) 患者的新生隐球菌临床株的配型及基因型分布特征, 为隐球菌病的诊疗提供科学依据。首先以M13 为单引物对模板DNA 进行聚合酶链反应( PCR) 扩增, 参照标准株指纹图将临床株鉴定至基因型; 同时对12 株来自AIDS 患者的新生隐球菌临床株的内转录间隔区( ITS) 基因进行PCR 扩增、序列分析, 以CLUSTAL W1. 83 软件多重比对分析ITS序列的差别,MEGA3. 1 软件处理数据, NJ 法绘制系统进化树, Bootstrapping 法对系统进化树结果进行统计学检验, 区分新生隐球菌格鲁比变种、新生变种及格特变种菌株; 最后选用特异性引物PCR 特异性扩增相关基因, 鉴定α和a 配型。结果显示, 分离自上海地区的12 株隐球菌临床株中, 9 株( 75% ) 为VNⅠ基因型/ α配型菌株,3 株( 25%) 为VNⅡ基因型/ α配型菌株, 且ITS基因序列分析可将各临床株鉴定至变种水平。本研究提示, 分离自上海地区AIDS患者的新生隐球菌临床株存在一定的遗传多态性, 以VNⅠ基因型/ α配型菌株为主, 有少量VNⅡ基因型/ α配型菌株。     

rDNA ITS序列在ACCC真菌鉴定中的应用

【目的】真菌无处不在,并与人类生活紧密相关。真菌的鉴定是科学研究和资源开发利用的基础。本研究从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)随机选取已经定名的112株库藏真菌菌株作为实验材料,通过DNA测序,评估核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列在真菌属级鉴定上的应用。【方法】采用真菌DNA条形码rDNA ITS的序列测定和在GenBank中查寻比对的方法,对这些菌株进行属水平的鉴定复核。【结果】通过研究,供试菌株中有80株的属名与原鉴定相符,同时表明序列中套峰的情况降低与Gen Bank中序列比对的相似性。【结论】rDNA ITS序列测定法可以用于真菌菌株进行属水平的鉴定复核,国家菌种保藏机构应对已入库保藏和即将入库的所有真菌菌株都进行属水平的鉴定复核,并对菌株鉴定结果作审慎处理,原定名的名称及其变更历史应以"曾用名"在数据库中保留。     

须癣毛癣菌的形态学及分子生物学鉴定

目的对临床上分离自人(36株)及狐狸(5株)的须癣毛癣菌菌株进行新的分类系统鉴定,并检测传统的分类方法是否能满足临床鉴定需要。方法①观察原鉴定为须癣毛癣菌菌株在沙氏培养基、1%蛋白胨培养基、溴甲酚紫乳固体葡萄糖琼脂培养基(BCP-MSG)和显微镜下形态学及尿素酶、毛发穿孔等生理学试验表现。②通过ITS区段和LSU区段分子生物学序列分析进行新的分类系统的菌种分型,并对传统形态学和生理学鉴定方法进行检测。结果①41株须癣毛癣菌形态学及生理学试验符合须癣毛癣菌(38株)和红色毛癣菌(3株)菌落的特点。②ITS区段序列分析发现ITS区段能将须癣毛癣菌和红色毛癣菌准确的鉴定到种,但无法明确其种内分型;而LSU区段序列分析可对36株(36/38)须癣毛癣菌有性型做出明确的鉴定。结论传统实验室鉴定方法仍具有其有效性及可靠性。通过分子生物学鉴定,临床分离的须癣毛癣菌皆为指(趾)间毛癣菌(38/38),而LSU区段的序列分析鉴定狐狸源性菌株皆属于本海姆节皮菌,有别于大多数人源性菌株有性型为万博节皮菌,对于须癣毛癣菌的菌种鉴定更优于ITS区段,但分子生物学试验还需结合形态学的观察,才能够对菌种做出正确的鉴定。     

基于ITS序列分析对杏鲍菇菌种的鉴定

采用拮抗实验和ITS序列分析结合的方法,对供试的20株菌株进行了分析。ITS序列分析结果表明,供试菌种的ITS序列长度为624 bp,与GenBank数据库中杏鲍菇菌种的ITS序列相似度为99%以上,在种的水平上证明供试菌种为杏鲍菇,同时构建的系统发育树将供试菌种聚在了4个类群。     

11个灵芝菌株的分子ID构建

[目的]收集11株灵芝菌种为材料,在分子水平上对其进行分类鉴定,并构建分子ID.[方法]采用ITS和SSR分子标记技术,对11株灵芝进行分子鉴定分析.[结果]通过内转录间隔区(ITS)序列测定分析表明,与GenBank上登录的灵芝(Ganoderma lucidum)菌株ITS序列相似度达到99％,在种的水平上证明实验所采用的供试菌株均属灵芝种(Ganoderma lucidum).利用SSR分子标记技术对菌株进行引物扩增,综合多态性条带,用NTSYS软件进行聚类分析,相似度在0.62水平上,1 1个灵芝菌种被分成4个类群,其中GL-2与GL-4各自聚为一类.用ID Analysis 1.0软件进行数据分析表明,用5对SSR引物可将11株灵芝供试菌种完全区分开,并构建其分子身份证.[结论]基于SSR分子标记构建灵芝菌属的分子ID是可行的.     

阴道分离因肯毛孢子菌的分子鉴定和种内分型

分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS1)测序,ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法,对三株因肯毛孢子菌Trichosporon inkin进行分子特征及种内分型研究。结果显示,不同菌株的rRNA基因ITS区和IGS1区的序列相似性均高达100%,RFLP酶切图谱具有较理想的种内一致性,而不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明:rRNA基因IGS1区测序及RFLP酶切可考虑用于因肯毛孢子菌的菌种分子鉴定,而基因组DNA的RAPD则较适合于菌种的种内分型。     

应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌

目的应用反向线点杂交技术(reverse line blot hybridization,RLB)快速鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌。方法收集我院真菌和真菌病研究中心保存的5种曲霉菌(烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉)和7种毛霉目真菌(冻土毛霉菌、总状毛霉菌、卷枝毛霉菌、少根根霉、小孢根霉、微小根毛霉、伞状犁头霉),共计98株菌株。利用真菌通用引物ITS1和ITS4对菌株进行PCR扩增,用12个真菌种特异性探针与扩增后产物进行反向线点杂交。将RLB结果与真菌传统形态学鉴定结果、ITS区DNA测序结果进行比较。结果 RLB可以正确鉴定98株实验菌株,与形态学方法和ITS区测序方法鉴定结果100%一致,种特异性探针之间未见交叉杂交,显示出该方法的高度敏感性和特异性。8株阴性对照菌株(白念珠菌、茄病镰刀菌、尖端赛多孢、马尔尼菲青霉、疣状瓶霉、棒曲霉、日本曲霉以及雅致小克银汉霉),使用RLB方法无法鉴定。通过烟曲霉基因组DNA浓度10倍倍比稀释法验证RLB的敏感性为1.8×10-3 ng/μL。结论 RLB技术为实验室早期快速诊断、鉴定临床常见的曲霉属和毛霉目真菌提供参考。     

一株产赭曲霉毒素A黑曲霉的筛选与鉴定

【目的】筛选出可产生赭曲霉毒素A (OTA)的霉菌菌株。【方法】利用CYA和YES培养基从实验室32个霉菌样品中筛选目的菌株。利用高效液相色谱-荧光检测法对OTA产生菌进行初筛,利用高效液相色谱-质谱联用对OTA初筛菌株进行复筛。通过菌落形态、菌丝及分生孢子形态、ITS DNA序列、β-Tubulin基因序列及Calmodulin基因序列分析等鉴定目的菌株。【结果】得到一株OTA产生菌株1062,该菌株能在25 °C条件下,在CYA、YES和CA培养基中很好生长。结合形态学、对培养基的要求以及上述3个基因序列的进化树分析,该菌株属于黑曲霉(Aspergillus niger)。【结论】菌株1062具有OTA产生能力,是一株黑曲霉。     

正己醇降解菌的分离、筛选及分类鉴定

为获得可降解正己醇的真菌菌种,分别以苹果园土壤、苹果渣、苹果酒醪和醋醅为分离源,采用富集培养和紫外线定向诱变,得到了两株能在pH3.8-4.0的条件下降解正己醇的真菌菌株TF和TM。菌株TM和TF在马铃薯葡萄糖培养液中对4.0mg/mL正己醇的降解率分别为45.60±5.43%和23.82±9.27%,与对照在α=0.01水平上差异显著。结合形态学特征及26S rDNA D1/D2区(菌株TM)和ITS区(菌株TF)序列分析,对两株菌进行了分类鉴定。结果表明:菌株TM属于地霉属Geotrichum,菌株TF为白地霉Geotrichum candidum(有性型Galactomyces geotrichum)。     

中国南北方地区临床孢子丝菌菌种鉴定

目的对分离自我国南、北方地区50株临床孢子丝菌进行菌种鉴定。方法分离菌株分别进行25℃恒温培养和玻片小培养,肉眼和镜下观察形态特征;同时提取菌丝相基因组DNA,用PCR分别扩增部分微管蛋白(β-tubulin)基因和核糖体内部转录间隔区(Ribosomal Internal Transcribed Spacer,ITS),扩增产物进行测序,并采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和邻接法(neighbor-joining,NJ)构建联合β-tubulin基因和ITS区域的系统发育树。结果结合形态学及系统发育分析,50株菌均鉴定为球形孢子丝菌(Sporothrix globosa,S.globosa)。结论球形孢子丝菌是目前我国南、北方地区孢子丝菌病的主要致病菌种,为进一步明确我国孢子丝菌病致病菌种的分布提供了依据。     

一种黄秋葵病原真菌的分离鉴定

报道一种在湖南地区发现的黄秋葵花蕾病原真菌。利用PDA培养基分离纯化病原菌株并依据柯赫氏法确定为病害的病原物,通过形态学鉴定和ITS序列分析鉴定病原种类。结果表明,从黄秋葵染病花蕾组织中分离纯化了一种病原真菌,通过形态观察以及ITS序列的比对分析,将该菌株鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus);其田间接种黄秋葵花蕾的致病率为80%。这是首次报道棘孢曲霉是黄秋葵花蕾病害的病原菌。     

具有细胞毒活性红树林真菌094811的鉴定

为鉴定合成细胞毒活性及多羟基甾醇脂肪酸酯新结构代谢产物的红树林真菌094811,采用形态观察、BIOLOG生理特征鉴定及核糖体18S rDNA测序对菌株094811进行了鉴定。菌株094811与模式菌株黑曲霉As3.40、泡盛曲霉As3.44形态特征极为相似,难以区分。扫描电镜下分别观察且比较菌株094811、模式菌株黑曲霉As3.40、泡盛曲霉As3.44分生孢子的形态,判断菌株094811为泡盛曲霉;根据BIOLOG微生物鉴定系统给出的相似菌种名称及综合形态和生理生化特征,推断菌株094811为泡盛曲霉;通过18S rDNA部分序列测序、GenBank比对,及系统演化分析进一步确认菌株094811为泡盛曲霉。菌株094811的形态、生理特征及其核糖体18S rDNA的序列特征给出了一致的结论。首次鉴定发现1株具有合成细胞毒活性及新的多羟基甾醇脂肪酸酯结构化合物的能力的泡盛曲霉。     

曲霉科五个中国新记录种

对分离自海南和辽宁滩涂沉积物中的曲霉属和青霉属菌株进行系统分类研究,报道5个中国新记录种：假溜曲霉Aspergillus pseudotamarii、乌尔米曲霉A.urmiensis、南极青霉Penicillium antarcticum、荒漠青霉P. desertorum和拉布拉多青霉P. labradorum,并提供了上述物种的形态特征描述及图示。同时,联合BenA和CaM基因序列进行系统发育分析,为形态学鉴定提供了佐证。研究结果丰富了我国该类真菌的物种多样性。     

烟曲霉rRNA基因ITS区的克隆测序分析

对烟曲霉rRNA基因内转录间区(ITS区)进行了克隆测序,并将之与其他几种常见曲霉的相应序列进行了比较.发现3株烟曲霉的ITSⅠ区完全相同,而其中1株烟曲霉的ITSⅡ区与一条已知相应序列仅有2个碱基的变异.提示烟曲霉rRNA基因的两个ITS区序列均十分保守,而且与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉的相应序列相比较,均有一定程度的变异.