马铃薯遗传转化体系的优化建立及其主要影响因素

植物基因转化的成功依赖于一个良好的转化系统,能有效地将外源基因导入受体细胞,并得以表达。通过农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系主要受基因型、预培养、菌液浓度及侵染时间、共培养等因素的影响,由于转化受体的异质性,有必要根据实际情况进行验证和改进,以获得最适转化条件。本研究以马铃薯无菌苗的叶片、茎段为外植体,通过农杆菌介导法,将抗马铃薯X病毒和Y病毒的RNA干扰型基因结构转入马铃薯。通过研究外植体预培养、菌液浓度及侵染时间、共培养等不同转化条件及影响因素对马铃薯遗传转化的影响,建立一种高效的马铃薯遗传转化体系,试验得出最佳转化条件为外植体预培养2 d,然后用OD600=0.5的农杆菌液侵染10 min,共培养2 d。本研究为下一步的对PVX和PVY双抗的马铃薯无标记转基因研究提供技术参考。     

口蹄疫病毒VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达

报道了FMDV VP1基因与马铃薯块茎专一性表达class Ipatatin基因5′区融合,经农杆菌介导导入马铃薯植株,PCR、RT-PCR证实了其整合及转录表达。ELISA结果进一步表明,VP1在转基因马铃薯块茎中具有免疫活性。为探讨在马铃薯块茎中高表达VP1蛋白及进一步开发其作为FMDV口服疫苗生物反应器奠定基础。     

一种马铃薯高效无标记转基因技术的建立

用农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种紫花白的叶盘,通过1/4 MS培养基预培养、热激处理、低pH、高糖培养基共培养,之后利用PCR直接检测转化体,结果表明遗传转化效率可达5.1%,建立了马铃薯无标记转基因技术.该技术受基因型的限制小,用于其它3个不同的栽培品种东北白、晋薯7号和早大白,遗传转化效率亦达到了4.1%~8.3%.利用这项无标记转基因技术,在载体构建时就剔除了标记基因,遗传转化后直接分化培养,不必对转化细胞进行抗性筛选,缩短了遗传转化周期,省去了费时费力的标记基因剔除步骤,亦为重复转化聚合多个优良基因提供了便利.     

高效马铃薯遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

本研究选用了三个马铃薯(Solanum Iuberosum L.)栽培品种“85T-14-3”、“86-2”及“Favorita”的块茎、微型薯和试管薯为起始材料,应用根癌农杆菌 Ti 质粒系统成功地建立了一种方法简单、速度快和频率高的遗传转化体系。其中试管薯薄片的转化速度最快,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养后,薄片在100mg/L 卡那霉素的分化培养上,2—3周就可产生出抗性小芽,这些小芽进一步仲长后可在50—100mg/L 卡那霉素的无激素MS 培养基上生根。从共培养到转化植株的获得只需6—7周。微型薯和试管薯的转化频率较高,最高可达67.5%。大多数抗性植株均能检测到胭脂碱合成酶或 GUS 基因的表达。把带有甜蛋白基因和胭脂碱合成酶标记基因的Ti质粒导入马铃薯,获得大量转化植株。叶片抗性检测和 nopaline 检测可推断外源甜蛋白基因已进入马铃薯基因组。     

根癌农杆菌介导转化马铃薯与抗病毒基因工程

病毒侵染一直是导致马铃薯品种退化的主要因素,严重影响马铃薯的产量和品质。近年来,随着基因工程的迅速发展和转基因技术体系的日益完善,基因工程技术在提高马铃薯抗病性（尤其是抗病毒）方面显示了极大的潜力,必将成为马铃薯抗病毒育种的主要手段。对其进展进行了综述,并讨论了根癌农杆菌介导马铃薯遗传转化及其体系优化因素。最后提出存在问题及发展趋势,以供广大马铃薯抗病毒育种工作者参考。     

转新型双抗虫基因棉花的遗传分析

首次用含合成的BtCrylAc活性杀虫蛋白嵌合基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体,通过土壤根癌杆菌介导转化棉花品种冀合321,获得一批抗虫的转化再生棉花植株。利用叶片涂抹卡那霉素、叶片离体养虫和PCR扩增等检测方法对6个不同转双抗虫基因株系的抗虫性进行遗传分析。结果显示,转化株系自交的T1抗虫性状遗传较为复杂;农杆菌介导获得的转基因抗虫棉在早期世代不易选到纯合系,但是随着对抗虫性状进行单向选择,到T4和T5就能获得抗虫纯合系。利用抗虫性稳定的转化后代材料和转化受体进行田间杂交,发现F2抗虫性分离完全符合一对或两对显性基因的分离规律,并证明了DR248和DR193两个材料为外源基因双拷贝插入。转化株系的Southern杂交也证明了上述结果。     

棒状杆菌发酵基因工程研究进展

传统的育种方法由于本身的缺陷受到了基因工程育种的强有力挑战,基因工程技术应用于发酵工业创立了全新的发酵基因工程。传统发酵菌种棒状杆菌的分子生物学研究欣欣向荣,棒状杆菌的受体系统、载体系统以及ＤＮＡ转移技术都已取得长足进展。对棒状杆菌的分子遗传机制的阐明使得构建表达载体并表达目的基因成为现实。利用基因突变和基因重组技术选育优良的棒状杆菌发酵菌种,业已取得明显成效。     

抗除草剂转基因大豆后代遗传分析

分析了来源于农杆菌介导的4个独立的大豆转化系的后代遗传特性。分别采用种子切片GUS染色方法和除草剂涂抹以及喷洒方法检测gus报告基因和抗除草剂bar基因在后代的表达。其中3个转化系T1代gus基因和bar基因能够以孟德尔方式3：1连锁遗传,说明这2个基因整合在大豆基因组的同一位点。这3个转化系在T2代获得了纯合的转化系,并能够稳定遗传至T5代。有一个转化系在T1代GUS和抗除草剂检测都为阴性,但通过Southern杂交证明转基因存在于后代基因组,显示发生了转基因沉默。为了证明转基因沉默是转录水平还是转录后水平,T1代植物叶片接种大豆花叶病毒（SMV）并不能抑制转基因沉默,说明该转化系基因沉默可能不是发生在转录后水平。     

施加外源抗坏血酸促进马铃薯试管薯形成及其机制初步研究

为研究抗坏血酸(AsA)处理对马铃薯试管薯形成和结薯相关基因表达的影响及敲除结薯关键基因Solanum tuberosum self-prunning 6A(StSP6A)对AsA诱导马铃薯结薯的效应,利用不同浓度(0、1、5、10、20和50 mmol/L)外源AsA处理2个二倍体马铃薯CIP-149(Solanum phureja)、CIP-178(S.ajanhuiri)和四倍体C-88(S.tuberosum)。结果表明,1~5 mmol/L外源AsA处理可显著诱导马铃薯块茎的形成。对10个块茎形成相关基因的表达分析结果表明,外源添加1 mmol/L AsA可显著影响块茎形成相关基因的表达,与对照相比,总体上呈正调控基因表达增强或负调控因子表达被抑制的趋势,特别是StSP6A在AsA处理过程中的块茎形成早期表达量极显著上调,敲除StSP6A可消除外源AsA对马铃薯块茎形成的诱导作用。这些结果表明,AsA诱导马铃薯块茎形成是通过调控与块茎形成相关的基因表达来实现的,而StSP6A在AsA诱导马铃薯块茎形成中起关键作用。     

马铃薯试管薯诱导及其遗传转化体系的优化

目的：对马铃薯试管薯诱导及遗传转化体系进行优化研究。方法：利用3种培养法对马铃薯品种甘农薯2号和Favorita进行了试管薯的诱导,并用农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。结果：用固体培养、固液培养和液体培养法诱导的甘农薯2号试管薯单瓶平均结薯数分别为4．6、4．4和6．5个,块茎平均直径分别为6．2、5．8和7．7ram;而Favorita单瓶平均结薯数为5．4、5．8和7．4个,平均直径分别达6．2、5．9和7．3mm。用浓度为OD600=0．5的农杆菌菌液侵染8min,共培养2d能够获得较高的转化频率。结论：液体培养法诱导试管薯的效果最好,建立的高频率遗传转化体系使甘农薯2号和Favorita的转化频率分别可达42．6％和36．8％。     

马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的导入

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株。经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达。     

Optimization of genetic transformation system of potato and introduction of maize starch branching enzyme gene SBEⅡb into potatoFAN

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系.通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株.经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达.     

花生遗传转化的主要方法和研究进展

花生遗传转化研究对于花生品种改良、新品种繁育具有重要意义。农杆菌介导的遗传转化法和基因枪法是花生遗传转化的主要方法。随着对花生研究的深入开展,花生的遗传转化技术也越来越成熟。介绍了农杆菌介导的遗传转化法和基因枪法在花生遗传转化研究中的应用现状及存在的问题。     

沉默马铃薯Sgt1-3基因减少块茎糖苷生物碱积累

马铃薯茄啶 糖基转移酶（solanidine glycosyltransferase,Sgt）家族成员Sgt1、Sgt2和Sgt3参与糖苷生物碱（glycoalkaloids,GAs）合成。已有研究证明,抑制该家族任一成员表达可影响马铃薯块茎中糖苷生物碱合成;然而,对Sgt家族成员的单基因实施调控很难有效降低块茎中总糖苷生物碱的积累。为降低马铃薯块茎中总糖苷生物碱的含量,本研究拟采用RNAi技术,对糖苷生物碱合成代谢途径末端酶基因家族成员Sgt1 3在转录水平进行共调控。为实现这一目的,构建了块茎特异性启动子Patatin驱动的,以Sgt1、Sgt2和Sgt3基因为靶向的RNAi表达载体pCEI-PFR,采用农杆菌介导法转化马铃薯茎段,获得10株可沉默Sgt1、Sgt2和Sgt3基因表达的Patatin RNAi融合基因的转基因植株。实时定量PCR（RT-qPCR）结果显示,Sgts基因的相对表达量分别降低了大约32%～60%（Sgt1）、29%～55%（Sgt2）和25%～66%（Sgt3）,而草甘膦抗性基因--5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS）的表达量则增加了约48%～135%。高效液相色谱法（HPLC）证明,尽管转基因株系的绿色组织中糖苷生物碱含量与野生型无显著差异,但块茎中糖苷生物碱分别比野生型降低了46%～59%（庄薯3号）和42%～62%（Favorita）。上述结果提示,复合沉默茄啶 糖基转移酶家族基因可降低马铃薯块茎中糖苷生物碱的积累。此外,该结果可能对研究马铃薯不同组织间糖苷生物碱的分布和积累,以及马铃薯种质资源的创新开发具有一定启示。     

沉默马铃薯Sgt1-3基因减少块茎糖苷生物碱积累北大核心CSCD

马铃薯茄啶-糖基转移酶(solanidine glycosyltransferase,Sgt)家族成员Sgt1、Sgt2和Sgt3参与糖苷生物碱(glycoalkaloids,GAs)合成。已有研究证明,抑制该家族任一成员表达可影响马铃薯块茎中糖苷生物碱合成;然而,对Sgt家族成员的单基因实施调控很难有效降低块茎中总糖苷生物碱的积累。为降低马铃薯块茎中总糖苷生物碱的含量,本研究拟采用RNAi技术,对糖苷生物碱合成代谢途径末端酶基因家族成员Sgt1-3在转录水平进行共调控。为实现这一目的,构建了块茎特异性启动子Patatin驱动的,以Sgt1、Sgt2和Sgt3基因为靶向的RNAi表达载体p CEI-PFR,采用农杆菌介导法转化马铃薯茎段,获得10株可沉默Sgt1、Sgt2和Sgt3基因表达的Patatin-RNAi融合基因的转基因植株。实时定量PCR(RT-q PCR)结果显示,Sgts基因的相对表达量分别降低了大约32%~60%(Sgt1)、29%~55%(Sgt2)和25%~66%(Sgt3),而草甘膦抗性基因——5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)的表达量则增加了约48%~135%。高效液相色谱法(HPLC)证明,尽管转基因株系的绿色组织中糖苷生物碱含量与野生型无显著差异,但块茎中糖苷生物碱分别比野生型降低了46%~59%(庄薯3号)和42%~62%(Favorita)。上述结果提示,复合沉默茄啶-糖基转移酶家族基因可降低马铃薯块茎中糖苷生物碱的积累。此外,该结果可能对研究马铃薯不同组织间糖苷生物碱的分布和积累,以及马铃薯种质资源的创新开发具有一定启示。     

牛生长激素基因在马铃薯中的表达

将牛生长激素基因ｃＤＮＡ 与Ｐａｔａｔｉｎ ＣｌａｓｓＩ启动子及ＮＯＳ３终止子连接,构建了表达载体ｐＰＢＧＴ． 用直接法将表达载体转入农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ） ＬＢＡ４４０４（ｐＲＡＬ４４０４）菌株, 用此菌株转化马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ）得到再生植株． 经ＮＰＴⅡ活性检测,总ＤＮＡ ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ证明目的基因已整合到马铃薯基因组中．ＲＮＡ 点杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明牛生长激素基因已在转基因马铃薯块茎中转录和表达     

除草剂抗性作物的大田试验

曾有人认为,用生物技术方法获得的除草剂抗性植物可能比遗传学上相似的除草剂感性品种产量更低.然而,比利时植物遗传系统公司的W.De Greef等人对具有glufosinate(phosphinothricin)除草剂广谱抗性的两个烟草和四个马铃薯系进行田间试验发现,它们与未转化的对照株相比,没有产量损失.尽管在烟草系中除草剂抗性基因的表达水平非常低.但当喷施除草剂剂量为通常田间剂量的四倍时也完全足以保护植物免遭其害.该除草剂抗性特征与植物品种无关,其它作物亦可应用遗传工程方法获得此特性.     

根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展

根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法 ,与其它方法相比 ,该方法具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化子等特点。目前 ,在根癌农杆菌介导下已实现了多个属种真菌的遗传转化 ,显示出良好的应用前景。综述了根癌农杆菌介导真菌遗传转化的转化机理和T DNA在真菌细胞中的存在方式等方面的研究结果 ,并展望这一方法的应用前景。     

粒子枪促进土壤杆菌介导的转化

Pioneer Hi-Bred的科学家D.Bidney及其同事们发现,在用根癌土壤杆菌转化植物组织之前,对该组织进行微弹轰击,可促进转化作用。Bidney的研究小组用钨粒子轰击烟草叶和向日葵顶端分生组织,然后用含GUS或卡那霉素抗性基因的根癌土壤杆菌处理。他们发现,与未经轰击的组织相比,前粒子轰击能提高转化频率。在产生卡那霉素抗性的集落中,对烟草叶进行微弹轰击和土壤杆菌的转化作用相结合至少比只用包有DNA的粒子轰击进行直接转化要有效100倍。在向日葵分生组织衍生的植株中可观察到相似的结果。     

转基因植物中外源基因的遗传学行为

１９８４年,首次利用农杆菌Ｔｉ质粒将外源基因导人烟草获得成功［１」,随后,转基因禾本科作物在水稻上也获得了成功［２,３］。随着各种遗传转化技术的创立与改进,近十几年来,在许多作物上都获得了转基因植株。植物遗传转化技术在基础研究和应用研究中的价值得到了很大体现。尤其是在应用研究上,植物遗传转化技术与常规的育种技术相比,它以超越种间隔离的特点吸引了广大的分子育种家投入到这方面的研究。迄今为止,许多有应用前景的基因已导入到双子叶植物和单子叶植物,并有少量转基因植物已释放到大田应用［４,５］。我们实验室…