新月柄杆菌RsaA分泌系统用于大肠杆菌胞外递送重组蛋白的初步研究

目的：构建基于新月柄杆菌RsaA外运机制的以大肠杆菌为宿主的原核胞外分泌表达载体系统。方法：利用分子克隆手段,按RsaA分泌系统操纵子组织方式,将RsaA系统外运功能基因配合以异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒。以绿色荧光蛋白（GFP）为报告分子、大肠杆菌M15为宿主茵,诱导表达后通过Western Blotting检测培养上清中GFP的表达。结果：获得了与设计完全一致的pQABPS载体,利用该载体系统,在培养上清中报告分子GFP的表达明显增加,且是通过特异的RsaA外运机制被分泌至胞外的,而非渗漏表达或简单的信号肽引导。结论：在大肠杆菌中重现了RsaA分泌系统的外运功能,为该系统在基因工程领域的应用研究打下了良好基础。     

大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效减少包涵体形成,简化纯化工序等诸多优势,近年来备受关注。其中,大肠杆菌I型分泌途径具有分泌表达速度快,蛋白活性高,对宿主代谢无影响等特点,是目前应用最广泛的分泌途径之一。综述了大肠杆菌I型分泌系统的元件组成和分泌机理及提高I型分泌系统蛋白表达量的有效策略,为重组蛋白生产应用提供了理论依据。     

大肠杆菌α-溶血素分泌途径研究进展

随着生物技术的不断发展,大肠杆菌胞外分泌分子机理日渐明晰,大肠杆菌表达系统成为实现规模化制备胞外重组蛋白的途径之一。本文综述了大肠杆菌α-溶血素分泌途径的转运机制及应用前景。     

乙型肝炎病毒S基因与截短C基因融合的穿梭表达载体的构建

研究目的是构建HBVS基因和截短C基因融合的胞壁型和分泌型大肠杆菌和分枝杆菌(E．coli-BCG)穿梭质粒。采用PCR方法从结核分枝杆菌MTB毒株H37Rv的基因中扩增出相对分子质量为19000的抗原胞壁区及其上游调控元件基因,克隆入穿梭载体pOLYG中。以含HBV基因组的质粒pCP10序列为模板,PCR扩增获得5基因片段Sw和C基因编码氨基端的部分基因片段Ct,克隆入胞壁型穿梭表达载体pCW和分泌型穿梭表达载体pDE22。经酶切和序列测定证实,胞壁型和分泌型载体pCW-Sw-Ct和pDE22-Sw-Ct构建成功。为进一步研究含S基因和截短C基因融合的重组BCG活疫苗奠定了基础。     

鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒的构建

生长激素(GH)是动物垂体前叶分泌的一种多肽类激素.应用分子重组及PCR等技术,构建了一种鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒pOsGH153,使编码鲑鱼生长激素成熟肽的序列克隆在大肠杆菌分泌型表达载体PIN-Ⅲ-ompA内,直接位于编码大肠杆菌外膜蛋白A信号肽序列的下游,在Lpp-Lac杂合启动子控制下,经IPTG诱导,分子量约23 000的鲑鱼生长激素在大肠杆菌中获得高效表达,该产物具有天然鲑鱼生长激素的免疫活性,直接分泌到细胞周质,而信号肽被自动剪除.     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α－淀粉酶基因在枯草杆菌中的表达和分泌

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列,将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ３１酶切,Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ⅱ及ｐＵＳＡ１８６Ⅰ系列质粒,将这些重组质粒转化枯草杆菌ＱＢ１１３０（ａｍｙ－）后都能向胞外分泌淀粉酶,酶活测定结果表明,基因表达水平比用原有的启动子高１－２倍,蛋白质分泌率在８４－９６％之间。     

人生存素survivin的克隆与分泌表达

旨在克隆人生存素( survivin)基因,并在原核系统中进行可溶性表达.采用RT-PCR方法从人乳腺癌细胞MCF-7中克隆survivin基因,将其重组到pAYZ表达栽体中,构建带有六聚组氨酸纯化标记的人survivin基因原核表达栽体pAYZ-survivin,将该载体转化大肠杆菌16C9进行表达.结果表明,成功克隆了survivin基因并构建了重组表达载体.融合蛋白主要以可溶性状态分泌到周质腔内存在.分离提取蛋白,HiTrap金属螯合柱进行亲和层析纯化,并经Western blot验证了高纯度survivin融合蛋白的表达.     

大肠杆菌α-溶血素分泌系统基因表达调控研究进展

引起人泌尿道感染的大肠杆菌(UPEC)的α-溶血素分泌系统属于Ⅰ型分泌系统,能够分泌一种RTX毒素蛋白-α-溶血素。近年来α-溶血素分泌系统的应用日益广泛,特别是在减毒活载体疫苗中呈递外源抗原。本分析了大肠杆菌α-溶血素分泌系统的遗传特性,详细介绍了其基因的表达调控,为构建更加有效的分泌型载体提供了理论基础。     

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏,仍然阻碍着质粒载体的优化,成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性,分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响,同时介绍了相关的解决办法,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达

将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白Ａ的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体,它能高效表达且有效地分泌表达产物,利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白,融合蛋白经ＣＮＢｒ裂解后,经反相ＨＰＬＣ分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达。方法从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序。将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21。IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达。结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白。结论成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。     

大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体的构建及内皮抑素基因的表达

目的:构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体,并通过此载体使人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中得到表达。方法:以质粒pDG7、pBCSK( )、pET-9C为基础,构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128,并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NQ-1501。诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果:成功构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体,人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中均可表达。结论:构建的穿梭载体为今后用双歧杆菌作为生理菌载体进行肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EspA和EspB蛋白的重组表达及其免疫效果

目的：通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的EspA和EspB蛋白,并分析它们的免疫保护性。方法：采用PCR技术从EHEC0157：H7基因组中扩增espA和espB基因,连接至pET-22b（4-）载体上,转化至宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,免疫小鼠分析其免疫保护性。结果：重组espA和espB基因片段的测序结果与GenBank中的相应基因序列完全一致,一致性均为100％;得到了纯度为95％以上的重组EspA和EspB蛋白,免疫小鼠所得到的抗体效价均为10^6。结论：重组EspA和EspB蛋白获得了可溶性表达,表达的蛋白具有良好的免疫保护性,为进一步制备疫苗奠定了基础。     

富含蛋氨酸玉米醇溶蛋白在大肠杆菌中的表达

目的:克隆玉米中富含蛋氨酸的10kD玉米醇溶蛋白,证明植物源目的基因在大肠杆菌中能够表达.方法:从玉米胚乳中克隆高蛋氨酸基因zein,通过PCR扩增zein片段,连接pGEX - 4T -1原核表达载体,转入大肠杆菌中,IPTG诱导后,HPLC测定蛋氨酸含量.结果:经PCR扩增出467bp条带,Blast分析同源性99%,经IPTG诱导进行SDS - PAGE检测,发现在36kD处出现一条明显的条带.诱导后菌体总蛋氨酸含量比正常菌体提高了9.6%.结论:证实了植物源10kD玉米醇溶蛋白在大肠杆菌中能够表达.     

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点,在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点,组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体,使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达,另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。