单纯疱疹病毒感染细胞膜系统脂质分子流动性的变化

运用荧光偏振技术了解单纯疱疹病毒(HSV)I型Sm44株感染非洲绿猴肾(Vero)细胞后细胞膜系统脂质分子流动性的变化.结果表明,在所观察的感染后的5个时相中(感染后0、7、14、21、28小时),感染早期(感染后0、7小时)细胞膜的流动性变化不大;感染晚期(14至28小时)细胞膜的脂质流动性明显增强,与未感染病毒的对照组细胞有显著差异,这提示HSV感染晚期的装配,成熟与释放是与被感染细胞的生物膜系统密切相关的.本文对运用该生物物理技术研究病毒和宿主细胞相互关系的意义进行了初步讨论.     

单宁酸体外抑制痘苗病毒感染活性的效果分析

目的:观察单宁酸体外抑制痘苗病毒(VACV)感染的效果,探讨单宁酸干扰病毒入侵宿主细胞膜脂的效应机制。方法:基于痘苗病毒细胞感染模型,在病毒吸附前、吸附后和吸附同时3种情况下分别添加单宁酸,采用中性红比色法检测单宁酸对VACV的抑制作用,利用荧光偏振法和流式细胞术分别测定VACV对细胞膜流动性和膜电位的影响及单宁酸的干预作用。结果:单宁酸以病毒吸附后及病毒吸附同时2种方式加入时可抑制VACV感染,半数抑制浓度(IC50)分别为8.7和13.1μg/m L,治疗指数(TI)分别为9.3和6.2;VACV感染可增加细胞膜流动性,单宁酸在病毒吸附后作用,可显著降低细胞膜流动性;VACV感染使细胞膜电位绝对值增大,单宁酸对VACV感染引起的细胞膜超极化状态没有明显影响。结论:单宁酸具有明显的体外抑制VACV感染宿主细胞的作用,其机制可能与拮抗因病毒感染所致的细胞膜流动性升高的膜脂干扰效应有关。     

065绿色荧光蛋白报告系统用于单纯疱疹病毒感染的快速诊断和定量

单纯疱疹病毒(HSV)是免疫功能低下患者感染和死亡的常见原因之一,因而有必要对当前HSV的诊断方法进行改进.基于对HSV复制过程的了解,可以利用源于病毒启动子的转录来鉴定感染病毒的细胞.据此,已将多种报告基因,如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ及荧光素酶,与控制核糖核苷酸还原酶大亚基的启动子HSV-1的ICP6或HSV-2的ICP10相连,即可在HSV感染后几个小时之内诱导其特异性表达作为检测方法,有些已用于临床.然而,这些方法需要固定细胞、加入底物或制备细胞裂解物,给操作带来不便.本文利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告系统建立一种简便直接的方法,可连续监测活细胞中HSV的感染.EGFP较绿色荧光蛋白(GFP)的荧光信号强35倍,可用荧光显微镜和流式细胞仪488nm氩离子激发光进行检测.     

单纯疱疹病毒感染细胞内环核苷酸含量的改变

用单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型Sm44株和Ⅱ型333株感染非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞),观察感染细胞中cAMP和cGMP含量的改变。病毒感染量均为0.5TCID50/细胞,观察周期为36小时(从接种病毒到CPE达++++),在感染后0、2、8、12、24、36小时分别收获细胞,以放射免疫法测定细胞内环磷酸核苷的含量改变。结果Ⅰ型、Ⅱ型HSV感染后在全部6个观察时期,细胞内的cAMP含量始终是升高的。HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ组的平均cAMP含量都明显高于正常细胞(P<0.05和P<0.02)。cGMP和cAMP/cGMP的变化不显著(表1)。     

植物多酚对5型腺病毒感染后宿主细胞膜流动性的影响

目的:观察两种植物多酚EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)、单宁酸对5型腺病毒感染后宿主细胞膜流动性的影响,初步探讨植物多酚抑制病毒作用机制。方法:利用DPH为荧光探针,以荧光偏振法观察5型腺病毒感染对宿主细胞膜流动性的影响,EGCG、单宁酸在此过程中对宿主细胞膜流动性改变的干预作用,结合CPE法测定的EGCG,单宁酸抑制5型腺病毒感染药效试验结果,以Spearman秩相关计算EGCG,单宁酸对宿主细胞膜流动性干预作用与其抑制病毒感染作用间的关系。结果:腺病毒感染细胞可提高宿主细胞膜流动性,滴度为100TCID50病毒可使293A细胞膜流动性提高15.34%。EGCG、单宁酸可抑制宿主细胞膜流动性,高浓度下分别可使宿主细胞膜流动性下降32.61%、25.75%。在病毒吸附前、吸附后、吸附同时,以EGCG、单宁酸处理宿主细胞,均发现宿主细胞膜流动性的干预作用与其抑制病毒感染效果高度相关(相关系数均0.900,P0.01)。结论:5型腺病毒感染会提高宿主细胞膜的流动性,而EGCG、单宁酸在干预腺病毒感染过程中对宿主细胞膜流动性的干预作用可能是其抑制腺病毒感染的机制之一。     

油桐尺蠖核型多角体病毒在Bs484细胞中的感染特性研究

本文研究了油桐尺蠖核型多角体病毒(简称BsNPV)在油桐尺蠖成虫卵巢细胞系(Bs484)中的以下感染特性:1.病毒接种传代3-4天的细胞时,病毒感染率最高;2.病毒按种量在一定范围内与感染细胞的多角体总产量平行;3.病毒在细胞中连续传代七次后其滴度无明显变化;4,病毒基因组在感染细胞后6小时左右开始合成,并于感染后14小时达到最大。此外,本实验还发展了一种用于检测感染细胞中的病毒核酸的简便方法。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒感染细胞的扫描与透射电镜对比观察

以感染复数为3的 HSV—Ⅱ(333株)感染兔婴肾单层细胞,不同间隔时间取材作扫描(SEM)及透射电镜(TEM)观察。感染1小时后,SEM 下显示细胞表面有大量病毒颗粒吸附,颗粒均匀分布或积聚成簇,多数病毒颗粒有囊膜,少数无囊膜。感染2小时后,变化与上基本类似,但有少数细胞变园。感染4小时后,变园的细胞数量增多,在此种细胞的核周区及边缘区积聚有大量病毒颗粒,而核上区则仅见少量散在的病毒颗粒,感染16小时后,部分细胞表面出现大小及形状不规则的孔洞;部分细胞解体成碎片,在孔洞边缘及细胞碎片中,可见有囊膜及无囊膜的病毒颗粒。病毒感染1—2小时后,TEM 下可见有囊膜及无囊膜的病毒颗粒吸附于细胞表面,随后在细胞表面的凹陷及胞浆小泡中,亦可见到类似的病毒颗粒。感染4小时以内的细胞超微结构变化主要有:髓膜的形成,线粒体肿胀,粗面内质网腔扩张及染色质边聚。感染16小时后,细胞呈现严重的变性及解体,在细胞碎片中,亦可见到有囊膜及无囊膜的病毒颗粒。对病毒的吸附,穿入,释放等问题进行了讨论.     

一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

膜脂物理状态的变化与肺腺癌细胞A549的顺铂耐药性

用荧光探剂DPH分别标记药物敏感的肺腺癌细胞A549和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A549/DDP, 对其膜脂物理状态的变化研究结果表明, 对顺铂药物敏感的A549的DPH各向异性值(P)为0.162, 而抗顺铂药物的A549/DDP者为0.194, 统计分析表明二者具有明显的差异. 当用可探测细胞膜脂双层不同层次的荧光探剂2-AS, 7-AS和12-AS进一步测定不同层次的膜脂质分子的流动性变化时, 结果表明: 分别反映膜表层和中层的2-AS和7-AS的各向异性值, 对敏感性的A549细胞分别为0.134和0.144, 具抗药性的A549/DDP细胞则分别为0.171和0.178. 而反映膜深层脂质分子变化的12-AS的各向异性值二者却无显著差异. 这提示, 两种细胞膜脂流动性的变化主要反映在膜的表层和中层. 同时, 用MC540荧光探剂标记两种细胞膜在FCM (flow cytometry)上测定反映膜脂质分子头部堆积程度差异的二维散点图及频数分布直方图的结果分析也表明, A549/DDP细胞膜脂质分子的有序性增加, 即流动性降低. 用气相色谱测量两株细胞膜脂肪酸的不饱和度, A549/DDP细胞膜脂肪酸的不饱和度明显低于A549细胞, 进一步肯定了上述结果. 结果提示, 在药物长期作用下, 膜脂物理状态的变化亦可能是肿瘤细胞具有抗药性的原因之一.     

HSV I感染L-02细胞对核不均一性核糖核蛋白H2(hnRNP H2)表达影响

单纯疱疹病毒(HSV I)对宿主细胞转录及mRNA修饰翻译通路的调控是一个系统的、复杂的体系,探索其具体机制将有助于了解病毒复制过程及与宿主细胞之间的相互作用.基于2-DE分析,人正常肝细胞L-02细胞核不均一性核糖核蛋白H2(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2,hnRNP H2)在感染HSV I前后存在表达差异,通过 Western blot,Northernblot等技术方法验证其在病毒复制过程中不同时段对其表达影响.     

一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建

为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2rep基因和AAV5cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将rep2cap5基因插入cos6粘粒上HSV1基因组片段的UL2基因中,而将EGFP的表达单位插入cos56粘粒上HSV1基因组片段的UL44基因中,用这2个重组粘粒与其它3个粘粒(cos14、cos28、cos48)共转染BHK-21细胞获得了重组病毒HSV1-r2c5-EGFP并进行了空斑纯化。HSV1-r2c5-EGFP病毒能够在BHK-21细胞连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR方法以及Southern杂交方法表明所获得的HSV1-r2c5-EGFP中携带有rep2cap5基因,用HSV1-r2c5-EGFP感染携带报告基因LacZ的AAV载体细胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/5-LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV1-r2c5-EGFP可提供AAV2/5载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒。     

四株单纯疱疹病毒(HSV)感染 四种细胞的SDS—PAGE分析

我们用 SDS—PAGE 测定四株 HSV 感染 HEp—2细胞、HeLa 细胞、人胚肺细胞、鸡胚细胞多肽与未感染细胞多肽的电泳图结果表明:四小时感染细胞多肽与未感染细胞多肽相比未见有区别,二十四小时的感染细胞多肽与未感染细胞多肽的电泳带显示有所区别。其中感染 HSV—1和 HSV—2型的鸡胚细胞多肽电泳带亦显示有所区别。说明鸡胚细胞对 HSV—1型和 HSV—2型的敏感性差异,亦可以从电泳带反映出来,说明电泳带可作为 HSV 分型的又一方法。经蔗糖梯度超离心纯化的未标记同位素的地方株 HSV—1CC21株和 HSV—2W 株病毒颗粒用 SDS 裂解,并进行 SDS—PAGE 表明这两株病毒的结构多肽分别为12和15种,显示型的区别。本文还就关于在制备疫苗时以选择何种细胞为宜的问题进行了讨论。     

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2在单纯疱疹病毒复制中的作用

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)与单纯疱疹病毒(HSV)等多种重要人类疾病病毒的复制密切相关.但具体哪种CDK是病毒复制所必需的还不清楚.本文用不同剂量的HSV-1-KOS株(以下简称HSV)感染CDK2功能缺陷型宿主细胞,结果发现HSV在CDK2功能缺陷型宿主细胞中的复制具有感染剂量依赖性;一步生长曲线分析结果表明其在CDK2功能缺陷型宿主细胞中的复制较在正常细胞延迟3h;感染6h时CDK2活性被诱导,9h时活性最大;CDK2活性增加后HSV-1即进入快速的裂解性复制.提示CDK2可能在HSV复制的启动中起着某种重要作用.     

Raji细胞培养中HSV持续感染模型的建立及免疫因素(TNF IFNs)对它的影响

本文观察HSV持续感染Raji细胞培养物150天。发现整个感染过程似呵分为两个阶段:急性期(前30天)和稳定期(30天以后)。在急性期上清液中HSV滴度达10~(6.2)TCID_(50)/ml.病毒抗原阳性细胞达21％,死细胞达42％;在稳定期病毒和细胞处于相对平衡状态,上清液中IISV滴度在10~(3.5-4.2)TCID_(50)/ml,病毒抗原阳性细胞约占5—10％,感染细胞与对照细胞在生长特性上无明显差异。用rIFNs、rlL-2和TNF处理稳定期的细胞培养物,发现TNF和rlFNa能明显抑制HSV的复制,rIENy作用较弱,去除上述因子5天后又恢复到处理前水平。rlL-2无明显作用。用HSV抗体处理上述细胞培养物上清液中病毒和病毒抗原阳性细胞都消失,且在去除抗体后连续观察50天仍未出现。本实验为体外研究HSV持续感染提供了一个有用的模型。     

脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白外用治疗单纯疱疹病毒感染

为探讨脑啡肽-干扰素α-m融合蛋白(EI)外用治疗单纯疱疹病毒感染的作用,分别用HSV-1感染兔子角膜、HSV-2感染豚鼠阴道建立动物感染模型.兔子角膜感染24h后用融合蛋白滴眼液治疗,每天3次,每次0.5ml,共14天.豚鼠阴道感染48h后,用融合蛋白涂剂抹外阴病灶,每天3次,每次10mg,共14天.用IFNα-m和生理盐水/赋形剂作为对照.采用记录病损程度分级法进行临床症消减观察,并于治疗前后测定实验动物病灶病毒滴度、HSV抗体滴度及NK细胞活性.结果显示:与IFNα-m相比,EI治疗组实验动物病毒感染症状大幅减轻且病程缩短,动物病灶中病毒滴度下降,抗HSV抗体滴度升高,NK细胞活性增强.说明脑啡肽干扰素融合蛋白具有较强的消除炎症和局部抗病毒作用,可用于治疗HSV感染引起的疾病.     

单纯疱疹病毒致病模型的研究

对单纯疱疹病毒（HSV）感染小白鼠致病特点进行了观察。小白鼠感染HSV第4天后开始发病,感染后2h血液内可分离出病毒,第48小时病毒血症水平和病毒检出率较高。不同组织病毒分布不同,脑、神经节在感染后第72小时病毒滴度较高,心、肝组织在第5天达到高峰。结果说明所建立的HSV致病模型可用于评价抗HSV药物。     

生长抑素对氧自由基引起的离体胃粘膜细胞损伤的保护作用及其机制

采用pronase—EDTA法分离大鼠胃粘膜细胞,将黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase,XO)—黄嘌呤(xanthine,X)氧自由基生成系统加入培养液诱发细胞的损伤。观察到预先加入生长抑素可以剂量依赖性地减轻XO—X引起的细胞死亡和乳酸脱氢酶的漏出;同时抑制XO—X引起的细胞脂质过氧化水平的升高,并翻转细胞膜流动性及溶血性卵磷脂与卵磷脂比值的变化。上述结果提示,生长抑素对氧自由基引起的胃粘膜细胞损伤可能具有直接的保护作用,其机制似与防止质膜的脂质过氧化并从而保护细胞膜免受损伤有关。     

BALB/c小鼠和雪貂感染H7N9禽流感病毒后的肺组织动态病理学变化

目的了解用H7N9禽流感病毒分别感染BALB/c小鼠和雪貂后,其肺部动态病理改变,为临床诊断、治疗、预防及机制研究提供帮助。方法 BALB/c小鼠经鼻腔接种106EID50(50μL)H7N9禽流感病毒后第1、2、3、5、7、14、28天分别安乐死2~3只小鼠;雪貂经鼻腔吸入接种106EID50(500μL)H7N9禽流感病毒后第3、7、14、28天分别安乐死1只雪貂,分别观察动物的临床特征改变,肺组织的大体组织形态学变化,HE染色观察动态病理改变,免疫组化染色观察病毒分布及肺组织各种炎细胞的浸润情况。结果感染病毒后的小鼠出现竖毛、嗜睡、死亡等表现,雪貂表现为打喷嚏、鼻腔分泌物、稀便、嗜睡等;大体观察小鼠与雪貂肺组织均可见到暗红色病灶;光镜观察小鼠与雪貂的肺组织均呈现坏死性支气管炎和渗出性间质性肺炎、肺泡炎。感染第2天开始出现炎性病变,7~9 d炎症病变最严重,14 d后逐渐修复吸收,28 d基本完全吸收;T、B淋巴细胞,巨噬细胞不同程度的表达增多,以T细胞增多为主,尤其是CD8+T细胞两种动物均大量表达。结论 H7N9禽流感病毒感染可引起BALB/c小鼠和雪貂肺组织急性支气管炎和肺炎,感染后7~9 d肺部炎症的组织病理学变化最严重,CD8+T细胞明显增多,14d后病灶逐渐吸收。该研究可为临床诊断、治疗、预防该病及进行疾病机制研究提供帮助。     

草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究

本文采用α-[~(32)p]ATP标记物在鱼肾细胞系(CIK)系统中,对草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)基因组进行了体内转录的研究。通过放线菌素D抑制宿主细胞基因组的转录活动,从感染病毒细胞中分离出病毒的mRNA,分别采用液相杂交和Nortbern blot方法检查病毒mRNA的转录情况。试验结果表明,GCHV含有内源性转录酶,其基因组的转录活动是在病毒感染细胞后4小时开始,由早期基因所转录,8—10小时获得晚期基因的转录产物。这些mRNA的大小、数目大体上与病毒基因组一致。     

HearNPV在生长对数期与平台期宿主细胞中的复制差异分析

使用实时荧光定量PCR技术对HearNPV在生长对数期和平台期HzAM1细胞的复制差异进行分析。结果表明,HzAM1细胞生长对数期的倍增时间为22 h,生长对数期的细胞以S期细胞为主(48.6%),而平台期细胞中以G2/M期细胞为主(72.6%)。在这两种不同状态的细胞中,病毒的复制主要在感染后60 h内完成,在感染后14~20 h,病毒复制倍增时间分别为1.8 h和1.9 h,几乎没有差别。但是感染生长对数期细胞时,吸附侵入细胞内的BV数量、BV释放的数量、最终的病毒产量以及病毒表达的蛋白产量明显高于被病毒感染的生长平台期细胞。如生长对数期细胞内复制合成的病毒DNA总量的25%装配形成BV病毒粒子出芽释放到细胞外,而对于平台期细胞,病毒DNA仅有13%装配形成BV病毒粒子出芽释放到细胞外。病毒感染两种生长状态的细胞,病毒DNA均从感染后7~8 h开始复制,没有明显差别;而生长对数期细胞从被感染后18~20 h释放子代病毒BV,生长平台期细胞则在感染后22~25 h开始释放病毒BV。在感染后30~60 h,在生长对数期被感染的细胞释放BV的速度约为483 copies/cell/h,而平台期细胞约为100 copies/cell/h。最初吸附侵入到生长对数期细胞内的BV粒子数量明显多于侵入到生长平台期细胞内的BV数量。实验证实,生长对数期与平台期的细胞膜的流动性有很大差别,推测健康细胞表面有活性的病毒受体数量可能决定了侵入细胞内的BV的数量。