基因敲除小鼠技术的研究进展

基因敲除小鼠技术的建立和发展使得人们为研究基因的功能和寻找新的治疗人类疾病的靶点提供了强有力的支持。基因打靶和基因捕获是两种通过胚胎干细胞(Embryonicstemcell,ESC)构建基因敲除小鼠的技术。基因打靶通过同源重组替换内源基因从而敲除目的基因,而基因捕获则有启动子捕获和polyA捕获两种方法对目的基因进行敲除。近年来,有许多新的基因敲除技术不断被开发出来,包括Cre/loxP系统、CRISP/Cas9系统以及最新的ZFN技术和TAILEN技术,都有望取代传统基因敲除手段。文中简要阐述了如今新出现的几种基因敲除小鼠技术。     

CREG基因敲除小鼠胚胎干细胞的筛选及鉴定

目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在发育过程中的作用,本研究拟通过高浓度药物筛选获得基因敲除的小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)。方法:用0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml、2.5 mg/ml及3.0 mg/ml 6个浓度的G418培养CREG杂合型(CREG其中一个等位基因被新霉素抗性neo基因替代)小鼠ESC 2周,确定最佳的G418筛选浓度。挑取该浓度下存活的ESC克隆进行扩增。将每个ESC克隆一半冻存,另一半贴壁培养。待ESC生长至80%融合后分别提取基因组DNA和蛋白。PCR方法扩增CREG基因明确基因组中是否存在CREG基因,WesternBlot方法鉴定是否有CREG蛋白表达。结果:确定2.0 mg/ml G418为最佳的筛选浓度。在该浓度下,共获得存活的克隆10个,PCR证实C2及C7克隆基因组中没有CREG基因,Western Blot证实C2及C7无CREG蛋白表达。结论:成功获得CREG基因敲除的小鼠ESC 2株,为深入研究CREG功能奠定了基础。     

基因敲除方法及其应用

基因（gene）是核酸分子中储存信息的遗传单位,是指储存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。基因敲除（Gene knockout）是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能;或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。     

基因打靶技术的研究进展

基因打靶在人类遗传病动物模型的构建,基因治疗和基因功能研究等方面都有重要的作用。本文综述了一些常用的基因打靶策略,并对这些技术的研究进展作一介绍。     

基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用

应用基因工程技术对微生物细胞内的代谢通量进行重新设计,是获得高产高效的工业菌株的重要手段之一。基因敲除是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路。或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量而达到调节代谢流,优化代谢途径的目的。简单介绍了基因敲除技术的操作过程,重点讨论基因敲除技术的敲除策略及在微生物代谢工程方面的应用,并展望了相关技术在诸多领域的发展趋势。     

大肠杆菌ptsG基因的敲除及其对L-phe生产的影响

L-phe是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成phe时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对phe产量合成有很大影响,在大肠杆菌PTS系统中,葡糖糖主要由ptsG基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得。利用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsG基因进行敲除,得到PTS缺陷菌株MD-ptsG-。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe产量提高12%。     

基因敲除动物的研究和应用

目的基因敲除动物是近十几年来发展起来的在个体水平上研究基因功能的一类实验动物,它以基因敲除技术和胚胎干细胞技术为基础,在生命科学研究的各个领域得到了广泛应用。最近两年发展起来的RNA干扰技术仍然不能代替它。本文综述了基因敲除动物在各医学生物领域的研究与应用、浅谈其与RNA干扰技术的比较及其发展前景。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

大鼠胎脑神经干细胞HPRT基因的敲除

根据已知大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HypoxanthineGuaninePhosphoribosylTransferase ,HPRT)基因的外显子序列 ,从大鼠HPRT基因组DNA序列的细菌人工染色体 (BacterialArtificialChromosome ,BAC)中用酶切和PCR方法分别分离得到用于构建基因敲除载体的 3 0kb的 5′长臂 (LongArm ,LA)和 1 7kb的 3′短臂 (ShortArm ,SA) ,并分别克隆到pSL1180和pCR2 1中。进一步构建大鼠HPRT基因打靶载体———pKO HPRT ,经酶切鉴定后的大鼠HPRT基因敲除载体用NotⅠ酶切使其线性化 ,经溴乙锭、正丁醇、酚、酚 /氯仿提纯后 ,将终浓度调至 1μg μl。在FuGene 6转染试剂的作用下转染培养 2 4h的第二代大鼠胎脑神经干细胞 (RatFetalNeuralStemCells,rFNSCs)。转染后的细胞用 80 μg mlG4 18和 0 2 μmol L的Ganc全培养液筛选 ,2w后将存活细胞进行悬浮培养 ,使细胞形成球形物 ,挑选单个的球形物进行单克隆增殖 ,其中一部分细胞 (约 2～ 3× 10 3)用裂解液处理 ,取上清用于PCR检测 ,大部分细胞 (5× 10 7)用于DNA和RNA的提取 ,进行Southernbolt和RT PCR检测 ,剩余细胞冷冻保存。最后 1次实验共分离培养了 32个rFNSCs单克隆 ,其中 3个单克隆 (9 3% )经PCR、Southernbolt和RT PCR证实HPRT基因已被敲除     

大肠杆菌pqqL基因敲除与功能分析

【目的】通过构建大肠杆菌pqqL基因缺陷突变株,研究大肠杆菌pqqL基因的功能。【方法】首先通过PCR扩增得到pqqL基因和kan抗性基因,在体外构建线性打靶片段pqqL-kan-pqqL。然后通过Red同源重组敲除大肠杆菌的pqqL基因,构建大肠杆菌缺失突变体DH5αΔpqqL。在此基础上通过DCIP法检测山梨糖脱氢酶活性来比较大肠杆菌突变株与亲本株中PQQ合成的情况。【结果】成功敲除了大肠杆菌的pqqL基因,DCIP法检测结果显示大肠杆菌pBCP162/DH5αΔpqqL和pMD19T Simple-pqqABCDE/DH5α能够合成PQQ,而大肠杆菌pMD19T Simple-pqqABCDE/DH5αΔpqqL不能合成PQQ。【结论】大肠杆菌pqqL基因和pqqF基因具有同样的功能。     

分枝杆菌中基因敲除操作工具研究进展

致病性分枝杆菌仍然是人类健康的重要威胁。相对于传统模式原核生物,在分枝杆菌中进行基因敲除一直是一个难题。文章介绍了分枝杆菌中用于基因敲除的转运载体和序列特异性重组系统的研究进展,并进一步介绍了新近发展的分枝杆菌重组工程在基因敲除中的应用。最后,对分枝杆菌基因敲除系统的发展历程进行了回顾,并对未来的发展方向进行了展望。     

基于Loxp-Cre系统的FBXL15基因敲除小鼠模型的建立

建立FBXL15基因条件型敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。采用KO first策略,构建打靶载体,将1st loxP插入1~2号内含子,在3~4号内含子之间插入FRT-SAIRES-lacZ-loxP-neo-loxP元件,通过Long Range PCR及Southern blot筛选出中靶克隆,随后进行囊胚注射,并将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫,最后将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得FBXL15-LoxP小鼠。PCR结果显示FBXL15的Loxp小鼠模型构建成功,该模型可为进一步研究FBXL15在胚胎发育和骨代谢中的调控作用提供工具。     

BAI1基因敲除打靶载体的快速构建

BAI1(脑血管生成抑制因子1)因其具有抑制血管生成的作用而得名,研究表明肿瘤的发生可能与BAI1的低表达有关.为了进一步探索BAI1的作用机制,运用改良的Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50 bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了BAI1基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,为后续的构建BAI1基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因功能奠定了基础.     

基因敲除在工业微生物育种方面的应用

微生物育种技术的发展先后经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种5个阶段,其中基因工程育种技术中的基因敲除技术具有定位性强、经修饰和改造的基因能够随染色体DNA的复制而稳定地复制的特点,使人们可以有目的地去改造生物的遗传物质,从而达到微生物育种的目的,受到人们的广泛关注。就基因敲除技术的几种主要方法及其在改良工业生产菌株中的应用作简要介绍。     

大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略

基因敲除技术是大肠杆菌基因组减小和代谢途径改造的有效手段,其中基于同源重组原理的基因无痕敲除技术显现出其他技术所不具备的应用优势和发展潜力。该技术可以快速敲除大肠杆菌基因组中的目标基因,并且在基因组中不残留任何外源片段,所以不会干扰后续的基因操作。我们分类介绍了无痕敲除技术中所涉及载体的结构、功能及其相应的敲除策略,着重介绍了无痕敲除技术的原理及载体构建方法。     

变性双链法实现葡萄糖异构酶基因敲除的研究

对７号淀粉酶菌Ｍ１０３３的遗传背景进行分析,建立了其原生质体制备、转化的优化条件。构建了葡萄糖异构酶（ＧＩ）结构基因内插千方百计以链丝菌肽基因（ｔｓｒ）的置换型同源重组质粒,利用其变性双链片段实现与Ｍ１０３３菌株染色体上基因的同源重组,获得置换型葡萄异构酶缺陷型蓖Ｍ１０３３ＬＪ。为在染色体上引入突变位点实现染色体上分子定点改造造尊定了基础。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水甲和蛋白质水半进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

GPR126条件性基因敲除载体的快速构建

基因敲除小鼠模型是在动物体内研究基因功能的重要和可靠的手段之一,而构建用于同源重组的基因敲除载体是构建基因敲除小鼠模型的关键一步.条件性基因敲除技术将针对靶基因的修饰作用限制在小鼠的特定发育时期或特定类型的组织细胞中,通过加入具有位点特异性的重组系统,该修饰作用在时间和空间上均处于可调控的状态;条件性基因敲除技术既可以避免某些具有重要功能基因的敲除所带来的早期胚胎致死问题,还可用于精确分析某些多效基因在不同组织或不同发育阶段的特定功能差异.通过合理利用改良的Red重组系统,将两个LoxP位点快速准确地插入到了目标位置,实现了GPR126条件性基因敲除载体的快速构建,为后续的构建GPR126基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因的功能奠定了基础.     

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组, 成功进行基因敲除已有报道, 但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛b 酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体, 设计不同的同源臂, 成功地敲除了b 酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列, 插入新的基因, 研究其表达功能, 或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5α、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株DH5αP、JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α、JM109的3.47倍和4.25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子（TNF）在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24.3%、20.8%,A600分别为8.28、7.62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。