山东一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与分析

目的:对青岛即墨地区发病的濒死鹦鹉进行诊断,并对BFDV进行全基因测序,分析其遗传进化规律.方法:利用PCR对发病鹦鹉进行BFDV的检测,并设计引物进行BFDV全基因组的测序.结果:BFDV核酸扩增为阳性,经PCR分段扩增法获得全基因组并完成了序列测定.QDJM01株全序列测定结果与GenBank中仅有的七株BFDV全序列进行同源性比较与进化树分析.经BLAST和DNAStar软件分析,QDJM01与其他七株BFDV同源性为99.0%～99.6%,为同一个基因型.结论:此病例为鹦鹉幼雏病病毒感染,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性.     

我国一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与初步分析

采用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖首次从湖北省云梦县分离的鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling disease virus,BFDV)分离株(BFDV-HBYM02),经PCR分段扩增法获得全基因组并完成序列测定.HBYM02株全序列测定结果与GenBank中仅有的六株BFDV全序列进行同源性与进化分析.经BLAST分析,HBYM02株与其他六株BFDV同源性为98%～99%,为同一个基因型.运用Phylip3.5软件构建进化树,分析显示,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性.     

我国一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与初步分析

采用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖首次从湖北省云梦县分离的鹦鹉幼雏病病毒(Budgerigar fledgling dis ease virus,BFDV)分离株(BFDV HBYM02),经 PCR分段扩增法获得全基因组并完成序列测定。HBYM02 株全序列测定结果与GenBank中仅有的六株BFDV全序列进行同源性与进化分析。经BLAST分析,HBYM02株与其他六株BFDV同源性为98%~99%,为同一个基因型。运用Phylip3.5软件构建进化树,分析显示,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性。     

一株保存的波瓦生病毒全基因组序列测定及分析

目的：对保存的WJBC株波瓦生病毒进行全基因组序列测定和分析,阐明其与已报道毒株之间的关系。方法：将波瓦生病毒基因组编码区分11段进行RT－PCR扩增,扩增产物直接进行测序,非编码区采用RACE法进行扩增,扩增产物纯化并连接pGEM－Teasy载体后转化大肠杆菌DH5ct感受态细胞,挑取阳性克隆鉴定后进行测序,用DNAstar软件将测序结果拼接得到全基因组序列。下载波瓦生病毒全基因组核苷酸序列,利用MEGA5．0软件构建系统进化发生树。结果与结论：WJBC株波瓦生病毒全基因组共11839nt,编码3415个氨基酸残基,病毒基因组5’端和3’端分别有111、483nt的非编码区;进化树结果显示,WJBC株波瓦生病毒与LB株波瓦生病毒的亲缘性最高,可能为同一病毒株．．     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

菊花R病毒杭白菊分离株全基因组序列测定与分析

杭白菊作为著名的中药“浙八味”之一,种植规模和产区不断扩大,但其病毒病的发生也日益严重,对其产量和品质造成严重影响。本研究利用双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）和非序列依赖PCR扩增（sequence independent amplification,SIA）等方法,对感病杭白菊病原物进行鉴定,为杭白菊病毒病原的检测构建一套快速和简便的方法。结果表明,感病杭白菊被菊花R病毒（Chrysanthemum virus R,CVR）侵染,将其命名为CVR-TX。通过对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其全长基因组为8 872 bp,编码6个ORF,具有Carlavirus属病毒的典型特征。基于全基因组核酸序列以及复制酶、外壳蛋白氨基酸的序列比对发现,CVR-TX与CVR-BJ同源性最高,分别为85.5%、96.0%和96.3%;与Carlavirus属其他病毒同源性分别在48.2%～54.4%、46.9%～55.3%和36.8%～59.5%,因此CVR被确定为一种新的Carlavirus属病毒。系统进化分析表明,基于全长基因组、复制酶（replicase）基因和外壳蛋白（coat protein,CP）基因与CVR-BJ聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了CVR-TX的全长基因组,丰富了CVR的基因组信息,通过生物信息学分析明确其种属关系和区域变化情况,从而为建立CVR可靠灵敏的分子检测手段和有效的防控措施提供理论基础。     

猪源脑心肌炎病毒GXLC株全基因组序列测定与分析

对猪源脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株进行全基因组克隆、测序和分析。采用RT-PCR技术分段扩增基因组可读框(ORF),应用3'-RACE和5'-RACE技术扩增3'-UTR和5'-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得GXLC株全基因组序列,共7725个核苷酸。与NCBI GenBank登录的国内外参考毒株进行同源性比较及系统进化分析结果表明,GXLC株与GX0601、GX0602、BJC3、HB1等国内分离株以及CBNU、K3、K11、BEL-2887A、EMCV-R、PV21等国外分离株同源性达99%以上;基于全基因组、结构蛋白及非结构蛋白基因序列绘制的系统进化树拓扑结构图相近,所有EMCV分离株可分成两个群:I群和II群,I群可细分为Ia亚群和Ib亚群,其中猪源EMCV属于Ia或Ib亚群、鼠源EMCV属于Ia亚群、野猪源EMCV属于II群,GXLC株与其它中国分离株均属于Ia亚群。     

一株赛鸽源鸽圆环病毒全基因克隆与序列分析

鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)是圆环病毒科的一个成员,是一种免疫抑制性病原。为了研究PiCV中国流行毒株的基因特征和遗传进化关系,本研究应用PCR方法对江苏省某赛鸽公棚的22份样品进行了PiCV检测,结果有6份样品为阳性。采用重叠PCR技术得到一株鸽圆环病毒全基因序列,命名为JS15-1(GenBank登录号:KX431143)。基因序列分析表明,JS15-1全长为2 034bp,包含3个主要开放阅读框。核苷酸同源性比较结果显示JS15-1与GenBank上登录的其他鸽圆环病毒分离株的全基因核苷酸同源性为85.3%~97.1%,与比利时分离的Bel20株同源性最高。不同鸽圆环病毒Rep基因同源性为92.1%~96.6%,Cap基因同源性为72.2%~99.4%。全基因遗传进化树显示JS15-1与之前的中国分离株处于不同的分支,而与Bel20的亲缘关系最近,Rep基因进化树显示JS15-1与Bel20、PiCV/Japan/2010、Ita4B位于同一分支,Cap基因进化树显示JS15-1与Bel20处于同一分支,亲缘关系最近。氨基酸序列比较发现,JS15-1与Bel20在Rep蛋白存在6个氨基酸残基的差异,而Cap蛋白存在1个氨基酸残基的差异和1个氨基酸残基的插入。研究结果表明,JS15-1极可能来源于比利时,而且发生了变异。     

猪水泡病病毒全基因组核苷酸序列的测定与分析

猪水泡病是由猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)引起的猪的一种急性传染病,在症状上与口蹄疫极其相似。该病流行性强,发病率高,能造成严重的公共卫生问题。国际兽医局将其列为动物A类传染病,我国农业部列为动物一类传染病。SVDV属于小RNA病毒科肠道病毒属,其核酸类型为单股正链RNA分子,无囊膜,病毒基因组含一个大的开放阅读框,编码一条由2185个氨基酸组成的多聚蛋白。     

一株MLB1型星状病毒全基因组序列分析

了解我国MLB1型星状病毒基因组特征,为星状病毒腹泻的防控提供基础数据。使用星状病毒通用引物筛查北京市丰台区2017年72份儿童腹泻监测病例标本;扩增MLB星状病毒全基因组序列,采用在线比对、进化、重组等生物学信息学方法分析MLB1的全基因组序列。从72份标本中检出2份1型星状病毒（2.78%）和1份MLB1型星状病毒（MLB1-FT）(1.39%)。MLB1-FT与GenBank已报道的MLB1型星状病毒全基因组相似性为92.51%～98.28%;MLB1-FT的三个ORF区,仅5个位点氨基酸与其他株均不相同。依据其ORF2部分序列的进化分析,MLB1可分为A和B两个组,其中A组可分为a和b亚组,MLB1-FT为A组中的b亚组。未发现MLB1-FT具有重组现象。MLB1-FT具有星状病毒特征性的保守基序,部分保守基序与其他型别星状病毒不一样,为MLB1星状病毒特有。MLB1-FT具备新型星状病毒MLB的典型特征。我国新型星状病毒监测力度较弱,应加强监测。     

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。     

一株重组乙型肝炎病毒的全基因克隆和序列分析

通过血清学和PCR方法对广西地区乙型肝炎病毒感染者样本进行检测,发现一株乙型肝炎病毒基因序列与其余病毒差异较大,利用PCR的方法,扩增出该株病毒的全长cDNA序列,并将其克隆到T载体,进行序列测定,结果显示基因全长为3 215bp,血清型为adr.将测定序列与网上公布的标准基因序列进行比对分析,发现该株病毒全基因组序列进化分析结果与C型基因比较接近,而对其全基因组进行分析时发现1 630bp～2 880bp间基因起源与和C型基因最为接近,而其余基因序列则与A型基因更接近,提示这是一株C型和A型重组的乙型肝炎病毒,首次在国内发现这种类型的基因重组病毒,丰富了我国乙型肝炎病毒研究内容,并对基因型别研究和病毒进化研究提供了参考.     

1株人乳头瘤病毒6型山东地方株的全基因组序列分析

人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)是引起生殖器疣与复发性喉乳头瘤的主要病原体之一.为明确2019年济南市1例尖锐湿疣患者的病毒基因组序列特征,本研究提取其尖锐湿疣组织标本总DNA,分两段进行HPV6全基因组PCR扩增和步移法Sanger测序,将拼接后的序列与全球36条不同来源的HPV6全基因组序列进行对比分析.结果 显示,1013/19/JN/CHN/HPV6株(以下简称1013/HPV6)基因组全长8031bp,属于变异谱系B1,与全球不同地区HPV6分离株序列的同源性为98.4％～99.9％.1013/HPV6株与B1亚谱系参考株AF092932全基因组序列相比具有19个核苷酸变异位点,分布在7个开放阅读框架(Open Reading Frames,ORFs)和非编码区内.本研究首次分析了分离自中国大陆的HPV6全基因序列特征,研究结果为HPV分子进化的进一步研究和分型诊断试剂的优化提供了数据.     

蚕豆萎蔫病毒2号板蓝根分离株全基因组序列测定与分析

板蓝根(Isatidis Radix)病毒病害的发生已对其产量和品质造成了严重影响。因此,建立一套灵敏、快速、有效的板蓝根病毒病害检测手段十分重要。本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)等技术对感病板蓝根进行鉴定,确定其被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2, BBWV2)所侵染。为明确BBWV2板蓝根分离物(BBWV2-IR)的进化关系,对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其RNA1序列全长为5 955 bp,RNA2序列全长为3 602 bp,分别编码由1 870和1 064个氨基酸组成的多聚蛋白质。序列比对发现,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am分离物的同源性最高,RNA2与BBWV2-SN分离物的同源性最高。全基因组变异情况分析表明,BBWV2-IR RNA1和RNA2分别与其同源性最高的株系存在多个氨基酸变异位点。系统进化分析表明,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am RNA1聚为一簇,RNA2与BBWV2-SN RNA2聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了BBWV2板蓝根分离株的全基因组序列,并明确其在进化过程中的地位和区域变化情况,为进一步研究BBWV2-IR致病性变异提供一定的理论基础。     

一株辛德毕斯病毒的基因组序列测定及分析

目的：对引进的一株辛德毕斯病毒的基因组序列进行测定,阐明其与已报道毒株序列的关系。方法：对辛德毕斯病毒基因组编码区进行分段RT-PCR扩增,对非编码区采用RACE法进行扩增,将扩增产物直接进行测序,应用DNAStar软件将测序结果拼接得到基因组序列,采用MEGA3.1软件对9株辛德毕斯病毒基因组序列进行系统进化发生树的构建。结果与结论：此株辛德毕斯病毒基因组共11663nt,编码3745个氨基酸残基,其中5＇端的2/3基因组编码4种非结构蛋白NSp1、NSp2、NSp3和NSp4,3＇端的1/3基因组编码5种结构蛋白E1、E2、E3、6K和C;结构基因和非结构基因之间有48nt的连接区为非翻译区;病毒基因组5＇末端和3＇末端分别有59、318nt的非编码区;序列同源性分析结果表明,此株病毒与S.A.AR86株的同源性最高,两者核苷酸序列的同源性为99.7%,氨基酸序列的同源性为99.6%,而与本室保存的另一辛德毕斯病毒MEI株的遗传进化关系稍远,系统进化发生树处于不同分支上。     

鹅源新城疫病毒ZJ1株全基因组的序列测定

依据GenBank上公布的新城疫病毒(NDV)的基因序列,自行设计了9对引物,运用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)获取覆盖NDV鹅源毒株ZJ1株全基因组的部分重叠片段。病毒RNA的5’及3’端的序列由cT)NA末端快速扩增技术(RACE)获取。整个病毒基因组序列由15192个碱基组成,比GenBank上公布的其它4个NDV毒株Beaudettec、B1、Lasota及Clone-30的全基因组序列长6个核苷酸。这6个核苷酸位于核衣壳蛋白(NP)基因内,相对于NDV毒株Lasota株全基因序列的1647nt～1648nt位。其它10个NDV毒株中的9个毒株也被验证具有此特征,且它们分属于3个不同的基因型。     

蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定. 序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2, BBWV2）. 为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2 Ca）的分类地位,对BBWV2 Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析. BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF. BBWV2 Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein, LCP）和外壳蛋白小亚基(small coat protein, SCP). 全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%～93.7%之间|RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%～93.8%之间. 全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近|RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.     

一株水貂博卡病毒全基因组扩增及序列分析

本研究旨在研究水貂博卡病毒（Mink bocavirus,MBoV）在山东省的流行状况及基因特征。采用PCR对采自山东省境内水貂养殖场的85份水貂腹泻样品进行MBoV检测,挑选1份单阳性样品进行全基因扩增,使用MegAlign进行序列同源性比对分析,利用DNAMAN V6对基因组5’末端和3’末端回文结构进行预测,应用MEGA V6进行遗传进化分析。结果表明,所采集的腹泻样品中MBoV阳性率为3.5%(3/85),其中1份为MBoV单阳性,2份为MBoV与水貂肠炎病毒（Mink enteritis virus,MEV）双阳性。获得MBoV全基因序列1条（SDMBoV2020）,全长5 252 bp;经分析,5’-和3’-UTR分别由98和145 bp短回文序列组成,具有典型的细小病毒末端的茎环样结构;基因组含有3个ORFs,分别编码非结构蛋白NS1、NP1以及结构蛋白VP1和VP2;SDMBoV2020与NCBI登录的MBoV参考毒株KU950356各编码基因的推导氨基酸序列同源性较高,为98.5%～99.0%;基于MBoV全基因序列构建的系统发育进化树也显示,SDMBoV2020和参...     

森林脑炎病毒疫苗株的全基因组序列分析

实验设计针对森林脑炎病毒的特异性引物,以被森林脑炎疫苗株病毒感染的鼠脑组织中提取的总RNA为模板,用PCR方法分段逆转录合成、扩增序列并测序,应用DNASTAR软件比较分析。结果表明,该病毒疫苗株的全基因组由10782个核苷酸组成,编码3414个氨基酸。森林脑炎疫苗株病毒全基因序列的测定,为研究该病毒疫苗株的生物学特性提供了分子基础。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株全基因组序列分析

为了明确传染性性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/SD09/005的分子特征,以进一步丰富国内IBV的分子流行病学信息。本研究设计了25对引物对其全基因组进行了序列测定,并与参考株进行了同源性比较和S1基因遗传进化分析。结果显示CK/CH/SD09/005基因组为27 691bp(不包括5′端Cap和3′端Poly A)。全基因组同源性比对发现,CK/CH/SD09/005仅与GenBank中广西2009年分离株GX-NN09032各基因高度同源(97%~99%)。除GX-NN09032外,CK/CH/SD09/005基因组5′端复制酶基因(Gene 1)和3′端非转录区(Untranslated region,UTR)与2个QX基因型参考株ck/CH/LDL/091022和SDIB821/2012同源性最高,分别为97%和98%,但是3′端结构蛋白和非结构蛋白基因(S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N)与这两个毒株同源性较低,仅为72%~90%。其ORF3c/E、5a、5b和N分别与韩国分离株1011、国内分离株CK/CH/LXJ/02I、DK/CH/HN/ZZ2004和YX10同源性最高,分别为97%、96%、99%和96%,而其ORF3a、3b和M与参考株同源性均低于90%。S1基因遗传进化分析发现,CK/CH/SD09/005和国内外39个参考株形成7个进化分支(基因型),CK/CH/SD09/005和2007以来几个分离株属于基因Ⅳ型,与其它6个基因型参考株S1和S2基因同源性为66%~69%和72%~81%,S1基因不仅表现广泛性点突变,而且有多处碱基插入和缺失,S2仅表现点突变。本研究结果表明CK/CH/SD09/005是一个变异株,可能是QX基因型IBV流行株与其它毒株重组进化而来,此外还涉及基因突变、插入和缺失等多种变异机制。