用小鼠模型分析表达牛结核分枝杆菌Ag85B重组腺病毒的细胞免疫特性

【目的】构建表达牛结核分枝杆菌抗原Ag85B重组腺病毒rAd-Ag85B,并用小鼠模型分析其细胞免疫特点。【方法】采用PCR方法,扩增结核分枝杆菌Ag85B的编码基因fbpB,测序后构建pDC516-Ag85B重组质粒。利用脂质体将pDC516-Ag85B与pBHGfrtΔE1,3FLP共转染Ad293细胞包装成重组病毒rAd-Ag85B。空斑纯化后用电镜负染、目的基因转录和蛋白表达进行rAd-Ag85B验证。同时将rAd-Ag85B和rAd(wtAd)分别经皮下注射免疫BALB/c小鼠,二免二周后取小鼠脾脏细胞,进行CD69表面分子表达、淋巴细胞增殖和ELISPOT实验分析。【结果】在电镜下能观察到包装的重组病毒粒子,且在转录和蛋白水平上验证了rAd-Ag85B构建成功。免疫试验结果显示,rAd-Ag85B能激活CD4+T和CD8+T细胞表面分子CD69的表达,并引起淋巴细胞增殖。ELISPOT表明rAd-Ag85B呈现Th1免疫特点。【结论】成功构建的rAd-Ag85B能引起机体针对PPD蛋白或Ag85B多肽的Th1免疫应答。     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

真核表达编码Ag85A基因重组体的构建

抗原85复合体（Ag85）是BCG合成的能够刺激机体产生细胞免疫和体液免疫的多种成分之一,Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。为研究经口接种Ag85A的DNA疫苗的免疫效应,根据结核分枝杆菌Ag85A的基因序列自行设计了一对PCR引物,以人型结核杆菌H37Rv标准毒力株的DNA为模板,经过PCR扩增出Ag85A目的基因,纯化PCR产物TA克隆入载体pUCm-T载体,蓝白斑筛选将回收的PCR产物用限制性核酸内切酶Xhol和BamHI双酶酶切后,经T4DNA连接酶作用,与真核表达载体pCDNA3．1^＋连接,筛选得到的阳性克隆经DNA测序鉴定证实为Ag85A基因,且被克隆到载体pCDNA3．1^＋中的CMV启动子的下游,成功构建并鉴定的真核表达载体pCDNA3．1^＋携带Ag85A基因的重组体,命名为pCDNA3．1^＋／Ag85A。将其转化大肠埃希菌并使之大量扩增,并采用无内毒素提取质粒方法收集此重组质粒DNA．即为可经口途径喂饲小鼠的结核杆菌Ag85A的DNA疫苗,为口服DNA疫苗的临床应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达

抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。     

结核分枝杆菌HspX蛋白的原核高效可溶性表达及产物抗原性分析

目的:利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌HspX蛋白并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增HspX核酸序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western印迹初步评价HspX的抗原性。结果:经IPTG诱导,HspX蛋白在原核系统内获得了可溶性表达,经镍柱亲和层析获得了纯度达95%以上的重组蛋白。Western印迹结果证明重组HspX蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论:重组蛋白HspX在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

Ag85A真核表达重组体的构建及稳定转染细胞系的建立

构建结核杆菌抗原85A（AgS5A）的真核表达重组体,转染L929细胞,建立稳定转染细胞系。从质粒V1 Jns．tPA—Ag85A中经PCR扩增出Ag85A基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体peDNA3．1／myc—HisA中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染L929细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,Western Blot检测Ag85A的表达。成功构建pcDNA3．1／mye—HisA—Ag85A真核表达载体并稳定转染L929细胞,成功表达了目的基因。为进一步研究Ag85ADNA疫苗对结核杆菌的免疫防护作用奠定了基础。     

针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）,并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）;PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）;PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠,共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞,外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加,CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6 和分泌蛋白 Hsp16.3 体外对人肝癌细胞HepG-2 的作用*

目的:探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hsp16.3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果:三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度10μg/ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、80μg/ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论:结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用

目的：探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法：将已构建的含5种目的基因的表达载体（pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6）,分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2＋亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果：五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论：Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

结核分枝杆菌PhoP系统研究进展

Pho P与Pho R组成的Pho PR是结核分枝杆菌重要的双组分调节系统。Pho P作为应答调节子调节基因的表达,这些基因参与细胞壁脂质合成,并对结核分枝杆菌毒力有重要调控作用。本文综述了Pho P的结构、性质以及相关的结核分枝杆菌疫苗研发情况,并提出了未来可能的研究趋势。     

结核分枝杆菌抗原蛋白的研究及其应用新进展

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性传染病,是仅次于正在暴发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的第二大单一感染致死病因。COVID-19的大流行对TB的诊断及治疗造成了破坏性的影响,全球实现终结TB目标的进展偏离了轨道。因此,早诊断、早治疗依然是防控TB蔓延的关键。TB精准诊断一直受MTB抗原特异性、检测技术特异性和灵敏度的影响,因此亟需挖掘高特异性新抗原、开发新检测技术。随着蛋白质基因组学(proteogenomics)和质谱技术的快速发展,从临床体液、组织样本中高效、精准靶向检测MTB特异性已知、甚至新抗原的表达,以及监测治疗过程中的抗原表达量的动态变化,是TB诊断及治疗的发展趋势。在MTB标准菌株H37Rv的4 008个注释基因中(NC＿000 962.3, NCBI),国内外报道的已注释抗原虽有140多个,但仅有极少的抗原应用于TB的筛查及辅助诊断,离世界卫生组织(World Health Organization, WHO)的诊断标准尚远。本文通过对MTB已报道抗原以及基...     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

结核分枝杆菌Rv0081基因编码蛋白的生物信息学分析

运用生物信息学分析软件预测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）Rv0081蛋白的生物学特征及筛选潜在的优势抗原表位。 从NCBI数据库获取Mtb Rv0081蛋白的氨基酸序列，利用生物信息学分析软件ProtParam、ProtScale及TMPRED分析Rv0081蛋白的理化性质及亲疏水性；TMHMM、SignalP-5.0 Server预测蛋白的跨膜区及信号肽；NetNGlyc-1.0 Server、NetPhos 3.1 Server分别预测蛋白的糖基化位点及磷酸化位点；STRING预测能与Rv0081相互作用的蛋白；分别运用SOPMA、SWISS-MODEL预测蛋白的二、三级结构；综合运用softberry、WoLF PSORT预测蛋白的亚细胞定位；运用DNAStar预测蛋白的B细胞抗原表位；综合运用SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、Net MHC pan 4.1 server预测蛋白的CTL细胞抗原表位；综合运用SYFPEITHI、Net MHCII pan 4.0 server预测蛋白的Th细胞抗原表位。 结果表明，Rv0081蛋白由114个氨基酸组成，相对分子质量为12 356.32，亚细胞定位于细胞质中，为稳定的疏水性蛋白，无跨膜区和信号肽，含有1个糖基化位点及9个磷酸化位点；二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，结构较松散；与hycE、hycP、Rv0088、Rv0083、hycD、hycQ、Rv0082、devR、Rv0080及Rv0079蛋白存在相互作用关系；综合分析各软件预测结果筛选出6个优势B细胞抗原表位、6个优势CTL细胞抗原表位及7个优势Th细胞抗原表位。Mtb Rv0081蛋白具有较多潜在的候选B、T细胞抗原表位，可作为研发新型结核疫苗的候选抗原。     

Physical and functional interaction between d-ribokinase and topoisomerase I has opposite effects on their respective activity in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis

d-ribose is an essential component of multiple important biological molecules and must first be phosphorylated by ribokinase before entering metabolic pathways. However, the function and regulation of ribokinases in Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, and its related species are largely unknown. In this study, we have characterized the activities of two putative ribokinases, Rv2436 and Ms4585, from M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis, respectively. The mycobacterial topoisomerase I (TopA) was found to physically interact with its ribokinase both in vitro and in vivo. By creating two ribokinase mutants that showed defective interactions with TopA, we further showed that the interaction between ribokinase and TopA had opposite effects on their respective function. While the interaction between the two proteins inhibited the ability of TopA to relax supercoiled DNA, it stimulated ribokinase activity. A cross-regulation assay revealed that the interaction between the two proteins was conserved in the two mycobacterial species. Thus, we uncovered an interplay between ribokinase and topoisomerase I in mycobacteria, which implies the existence of a novel regulatory strategy for efficient utilization of d-ribose in M. tuberculosis that may be useful in stressful environments with restricted access to nutrients.     

相对定量分析异烟肼、链霉素单耐药与多耐药结核分枝杆菌临床分离株的蛋白质组差异

【目的】探讨异烟肼(isoniazid,INH)、链霉素(streptomycin,SM)单耐药结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)与INH/SM多耐药MTB蛋白质组差异。【方法】应用i TRAQ结合Nano LC-MS/MS定量蛋白质组学技术,分析临床分离INH、SM或INH/SM耐药MTB与H37Rv标准株间均表达差异蛋白;并以INH/SM耐药MTB与H37Rv比值为对照,相对定量分析单耐药与多耐药MTB蛋白表达差异倍数;运用DAVID 6.7分析差异蛋白生物功能;STITCH 5.0分析差异蛋白与INH和SM相互作用。【结果】与H37Rv标准株比较,58个蛋白在INH、SM耐药与INH/SM耐药MTB间均有表达差异,共同差异蛋白生物功能主要为氧化还原酶活性和转移酶活性;主要参与丙酸代谢信号通路。共同差异蛋白中,与INH/SM耐药MTB比较,Rv2986c和Rv1908c在INH、SM耐药MTB均表达上调1.25倍;Rv3133c和Rv0577则均表达下调0.7倍;生物信息学预测发现以上4种蛋白可直接或间接与INH、SM进行相互作用。【结论】INH、SM单耐药和INH/SM多耐药MTB蛋白表达谱有较大差异,蛋白Rv2986c、Rv1908c、Rv3133c和Rv0577表达水平及相互作用可能与INH和SM耐药有关。     

Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimM sequence for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis

Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis are pathogenic bacterial species in the genus Mycobacterium and the causative agents of most cases of tuberculosis (TB). Detection of M. tuberculosis and M. bovis using conventional culture- and biochemical-based assays is time-consuming and laborious. Therefore, a simple and sensitive method for rapid detection has been anxiously awaited. In the present study, a visual loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was designed from the rimM (encoding 16S rRNA-processing protein) gene sequence and used to rapidly detect M. tuberculosis and M. bovis from clinical samples in South China. The visual LAMP reaction was performed by adding calcein and manganous ion, allowing the results to be read by simple visual observation of color change in a closed-tube system, and which takes less than 1 h at 65 °C. The assay correctly identified 84 M. tuberculosis isolates, 3 M. bovis strains and 1 M. bovis BCG samples, but did not detect 51 non-tuberculous mycobacteria (NTM) isolates and 8 other bacterial species. Sensitivity of this assay for detection of genomic DNA was 1 pg. Specific amplification was confirmed by the ladder-like pattern of gel electrophoresis and restriction enzyme HhaI digestion. The assay successfully detected M. tuberculosis and M. bovis not only in pure bacterial culture but also in clinical samples of sputum, pleural fluid and blood. The speed, specificity, sensitivity of the rimM LAMP, the lack of a need for expensive equipment, and the visual readout show great potential for clinical detection of M. tuberculosis and M. bovis.     

Differential immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines expressing proteins of Mycobacterium tuberculosis in a mouse model

BALB/c mice were vaccinated three times (2-week intervals) with plasmid DNA separately encoding antigen Ag85B, ESAT-6 or Ag85A from Mycobacterium tuberculosis. The protective efficacy of these DNA vaccines against intravenous M. tuberculosis H37Rv challenge infection was measured by counting bacterial loads in spleen and lung and recording changes in lung pathology. The splenocyte proliferative response to the corresponding antigens and antigen-specific interferon (IFN)-γ secreted by splenocytes of the vaccinated mice were also detected. We found a clear hierarchy of protective efficacies among the three DNA vaccines tested in this study. Plasmid DNA encoding Ag85A provided the strongest protection and showed the least change in lung pathology, followed by plasmid DNAs encoding Ag85B and ESAT-6. However, DNA-85B reduced comparative bacterial load in lung tissue, as did DNA-85A. Compared to the control group, protective efficacies conferred by different DNA vaccines were consistent with the lymphoproliferative responses to the corresponding antigens as well as the secretions of antigen-specific IFN-γ. Our study demonstrates that both Ag85A and Ag85B are the most promising of the candidate antigens tested for future TB vaccine development.     

结核分枝杆菌EsxV脂质体纳米颗粒亚单位疫苗的制备及免疫学特性

本研究旨在制备脂质体纳米颗粒（lipid nanoparticles,LNP）为载体的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）抗原EsxV亚单位疫苗,明确该疫苗经黏膜免疫诱导的免疫应答水平。采用薄膜分散法制备包裹蛋白EsxV和c-di-AMP的LNP （EsxV：C：L）,并对其包封率、LNP形态、粒径、表位电荷及多相分散指数进行了检测。EsxV：C：L滴鼻免疫BALB/c小鼠,检测免疫后血清和黏膜抗体、肺或脾细胞因子转录及分泌水平、肺T细胞亚群细胞比例。结果成功获得大小均一、呈球状、带负电的EsxV：C：L LNP亚单位疫苗。与EsxV：C相比,EsxV：C：L鼻黏膜接种可诱导小鼠呼吸道黏膜sIgA水平增加,脾细胞因子IL-2分泌水平升高,提高中央记忆T细和组织驻留T细胞的比例。综上,EsxV：C：L经黏膜免疫,可诱导更强的黏膜免疫和记忆性T细胞免疫应答,可能提供更好的抗Mtb感染的保护作用。