斑马鱼Lefty1特异性多克隆抗体的制备

Lefty蛋白是TGFβ大家族的配体,通过与Nodal以及Nodal的受体结合而抑制Nodal信号转导。本文采用PCR技术扩增出斑马鱼lefty1基因（z—lefty1）的部分编码区,将其插入到pGEX-4T-1原核表达载体中。所构建的重组质粒（pGEX／z-Lefiy1）转化入BI21大肠杆菌,通过IPTG诱导表达GST—z—Lefty1融合蛋白。蛋白经尿素洗涤分离后用于免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。Western blotting检测结果表明获得了高效价的特异性兔抗z—Lefiy1多克隆抗体。这为进一步研究斑马鱼心脏发育的分子机制创造了条件。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

百脉根小G蛋白Rac1基因的克隆与功能分析

小G蛋白Rop在植物细胞信号转导中发挥着重要的分子开关功能。该实验通过RT-PCR方法克隆了百脉根的一个Rop编码基因LjRac1,并对LjRac1基因序列进行生物信息学分析,然后采用半定量RT-PCR检测LjRac1基因在百脉根不同组织中的表达,用荧光实时定量PCR方法检测百脉根接种根瘤菌后LjRac1基因在不同阶段根系中的表达,构建过表达重组质粒,利用发根农杆菌介导的遗传转化法对LjRac1基因功能进行分析。结果表明:(1)序列分析显示,LjRac1完整编码区的cDNA序列长度为594bp,编码197个氨基酸,其编码蛋白具有典型的Rop家族保守结构域;同源分析显示,百脉根LjRac1与大豆GmRac1、野大豆GsRac1的一致性最高(94.42%)。(2)LjRac1基因在百脉根的根、茎、叶、根瘤和花中均有表达,且在根和根瘤中的表达水平较高;接种根瘤菌0.5h后,LjRac1基因在根系中的表达量呈显著升高趋势。(3)过表达转基因植株中LjRac1mRNA的表达水平为对照植株的14.3倍,且过表达植株的结瘤数目较对照明显增加。研究认为,LjRac1基因是一个受根瘤菌诱导增强表达的基因,过表达LjRac1基因可以引起植株结瘤数目的增加,说明LjRac1基因可能参与早期结瘤信号转导途径,从而在根瘤的发育中发挥一定作用。     

大鼠RVLG cDNA的克隆、原核表达和小鼠抗RVLG蛋白多克隆抗体的制备

为了识别大鼠卵巢中的生殖细胞,在原核系统中表达和纯化RVLG蛋白并制备了多克隆抗体.采用RT-PCR方法从大鼠睾丸组织中扩增获得RVLG cDNA片段,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,经双酶切回收目的基因片段后,将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.纯化后的GST-RVLG融合蛋白免疫昆明(KM)小鼠,最后给小鼠腹腔注射S180细胞制备抗RVLG腹水多克隆抗体.用Western blotting及免疫组织化学法鉴定RVLG腹水多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定该抗体的效价.序列分析表明,所克隆的RVLG cDNA片段比GenBank中报道的大鼠RVLG cDNA(NM_001077647)多60 bp,原因是由于RVLG的可变剪切方式造成的.本研究成功构建了重组表达质粒pGEX-RVLG,且GST-RVLG融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10%以上.制备的抗体可特异性识别RVLG蛋白,其效价达1:20 000.获得的高效价、高特异性的小鼠抗RVLG蛋白腹水多克隆抗体为下阶段研究RVLG的特异性表达奠定了基础.     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

精子特异性蛋白Cabs1多克隆抗体的制备及多用途验证

制备抗小鼠Cabs1 (Calcium-binding and spermatid-specific protein 1)多克隆抗体,以便进一步利用小鼠模型解析Cabs1蛋白在精子变形与精子功能调控中的功能.以密码子的简并性和偏好性为原则,优化小鼠Cabs1基因编码序列,构建重组表达载体ET-30a(+)/Cabs1,...     

水稻Argonaute 2蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备水稻Argonaute 2(AGO2)的多克隆抗体,该研究采用RT-PCR扩增OsAGO2蛋白165~401aa片段和440~570aa片段的编码序列,并构建了2个原核表达载体。诱导表达重组蛋白后注射家兔,制备了相应的多克隆抗体,最后利用Western blot初步分析水稻AGO2蛋白的表达模式。结果表明:成功构建2个表达载体,通过诱导获得了分子量约为30kD和23kD的重组蛋白。其中,以440~570aa片段为抗原所制备的多克隆抗体免疫印记效果较好。Western blot表明在水稻花药、愈伤组织及小穗中检测到OsAGO2表达。该研究为进一步深入探讨水稻OsAGO2基因的特性与功能奠定了基础。     

小菜蛾普通气味结合蛋白2基因的原核表达与多克隆抗体制备

本实验提取羽化3 d的小菜蛾Plutella xylostella成虫触角总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板PCR扩增出小菜蛾普通气味结合蛋白2基因,大小为492 bp,Blast结果显示与多种昆虫的GOBP2具有较高的同源性.将该基因克隆到表达载体pMAL-c4E中,转化宿主菌TB1(DE3),获得单克隆重组质粒pMAL-c4E-GOBP2.IPTG成功诱导pMAL-c4E-GOBP2表达出约60 kDa的融合蛋白.优化诱导条件为3 mmol/L终浓度IPTG、6 h,可获得大量可溶性蛋白.表达的融合蛋白通过亲和色谱法纯化、免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.ELISA分析表明制备的抗体效价达1:1.28×105.     

文昌鱼BRA蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Brachyury编码的转录调控因子BRA参与脊索动物脊索的分化形成,文昌鱼是最早具有真正脊索的后生动物类群,因此开展文昌鱼Brachyury基因功能研究,将有助于揭示脊索的起源与进化。文昌鱼具有2个Brachyury基因:Bra1和Bra2,二者编码的蛋白序列相似度高达93%,缺少有效区分二者的特异抗原表位,转录组数据分析表明Bra2表达量显著高于Bra1,进一步对BRA2蛋白序列特征分析发现其N端拥有丰富的潜在抗原决定簇,因此本研究选择了Bra2 N端696 bp基因序列所编码的蛋白片段作为制备抗体的抗原蛋白。将该段基因序列克隆重组入p ET28a原核表达质粒,经诱导表达获分子量约31 ku的可溶性重组蛋白。通过Ni2+亲和层析柱纯化,得到1.3 g/L高纯度抗原蛋白,用3只ICR小鼠(Mus musculus)经4轮重组蛋白免疫[剂量50μg/(只·次)]后获得最高效价(1︰256 000)的多克隆抗体。Western印迹结果显示,本研究制备的鼠抗文昌鱼BRA多克隆抗体不仅可特异识别重组抗原蛋白,也可高效识别文昌鱼胚胎总蛋白中的BRA1和BRA2,为后续深入研究文昌鱼BRA在脊索发育调控中的作用提供了有力的分子工具。     

卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis,Mc)表面蛋白UspA1胞外结构域的多克隆抗体(PcAb),对UspA1蛋白进行生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段,找到其对应的基因序列并引入大肠杆菌偏好性密码子,对其优化后化学合成全基因序列。将该基因序列按常规方法克隆入表达载体p ET-28a(+)后表达重组UspA1-His融合蛋白并纯化。以该纯化抗原免疫新西兰大白兔,经4次免疫后,用Protein A亲和层析柱从抗血清中纯化出抗UspA1-His融合蛋白PcAbIgG。经免疫荧光法、酶联免疫吸附法及Western blotting鉴定,抗UspA1-His融合蛋白PcAb能特异性识别UspA1蛋白的表面暴露区。该多抗的制备为下一步建立卡他莫拉菌快速检测技术奠定了基础。     

黄瓜过敏性诱导反应蛋白基因(CsHIR1)原核表达及其多克隆抗体制备

该试验用黄瓜霜霉菌侵染黄瓜幼苗,并通过PCR方法克隆其过敏性诱导反应蛋白(HIR)的基因CsHIR1,构建原核表达载体pET28a-CsHIR1,实现在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达;对诱导表达的时间和IPTG的浓度进行了优化;利用钴离子螯合层析纯化了重组蛋白并制备高效价多克隆抗血清。结果表明:该黄瓜过敏性反应诱导蛋白以包涵体的形式表达,最佳诱导时间和IPTG浓度分别为4h和0.5mmol·L-1;经纯化,得到高纯度的分子量为34kD重组蛋白CsHIR1。Western blotting显示CsHIR1的抗体具有较好的特异性。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能奠定了基础。     

黄瓜CsERECTA基因的原核表达及其多克隆抗体制备

ERECTA基因编码一个富含亮氨酸重复序列结构的丝/苏氨酸类受体蛋白激酶,参与调控植物器官的形态建成,在株型控制及抗逆方面也有重要作用。该研究通过构建带有maltose binding protein(MBP)标签的pET21a-CsERECTA融合蛋白原核表达载体,实现了在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的高效表达,并对诱导表达的温度、时间和IPTG浓度进行了优化。利用镍离子螯合层析纯化得到MBP-CsERECTA融合蛋白,再用rTEV蛋白酶对其进行酶切,得到CsERECTA蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体。结果表明,黄瓜CsERECTA蛋白以可溶和包涵体2种形式表达,低温有助于蛋白以可溶性形式大量存在。最佳诱导温度为23℃,诱导时间为6h,IPTG浓度为0.5mmol·L~(-1)。通过Western blot可检测到黄瓜内源的CsERECTA蛋白,说明制备的多可隆抗体具有较好的特异性。多克隆抗体的成功制备为进一步研究CsERECTA的功能奠定了基础。     

拟南芥LFR原核重组蛋白纯化和多克隆抗体制备

拟南芥中有一类含ARM结构域的蛋白质,研究表明它们中的一些在植物的生长发育和激素应答等方面发挥着重要的作用.在拟南芥突变体筛选中,获得了一个推测编码蛋白含ARM重复序列的新基因突变体lfr(leaf and flower related mumnt),它在叶子和花的发育过程中表现出较明显的表型.为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,构建了pGEX-2TGST:LFR融合蛋白重组表达载体,将重组质粒转化到工程菌中诱导表达菌体蛋白,经SDS.聚内烯酰胺凝胶电泳检测,结果表明,融合重组蛋白成功获得了高效表达,分子质量在77 ku左右.重组蛋白经谷胱甘肽S.转移酶(GST)标签蛋白亲和层析法纯化,SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到纯度较高的抗原.经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清.采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化,结果得到只识别LFR重组蛋白的抗血清.进一步提取拟南芥野生型及突变体的核蛋白,经蛋白质印迹检测,结果显示,在分子质量50ku左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗血清可以与拟南芥LFR蛋白特异性结合.     

水稻LRR型类受体蛋白激酶胞外区的原核表达及多克隆抗体制备

前期研究表明,水稻根尖细胞质膜类受体蛋白激酶OsRLK的表达受盐胁迫诱导.为了进一步研究该激酶的生理功能,通过反转录PCR得到OsRLK胞外区cDNA片段,将其亚克隆至pET29a原核表达载体并在大肠杆菌中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%.重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化得到1:20 000效价的多克隆抗体.Wescem blot结果显示,该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型类受体蛋白激酶,并且在蛋白质水平证实该激酶为盐胁迫响应蛋白.     

单增李斯特菌prsA1基因的截短表达、纯化及多克隆抗体的制备

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌,能够引发李斯特菌病,对食品安全构成巨大威胁。prsA1具有保守性和特异性,利用SignalP 4.1 Server程序、TMHMM Server V.2.0程序和SEPPA 2.0程序预测了PrsA1的信号肽段、跨膜区域及空间抗原表位,预测结果显示PrsA1的N端含有信号肽段及跨膜区且该蛋白具有良好抗原表位结构,因而可作为检测靶标。在此基础上,采用PCR法获得prsA1的非跨膜区序列即Δ84prsA1,构建重组质粒pET30a-Δ84prsA1并转入到大肠杆菌中诱导表达Δ28PrsA1,Ni-IDA柱亲和纯化重组蛋白Δ28PrsA1,以纯化的Δ28PrsA1为抗原制备多克隆抗体。间接ELISA检测多克隆抗体的效价,高达1∶128 000。Western blotting分析结果显示该多克隆抗体能够识别从单增李斯特菌中提取的PrsA1蛋白。利用生物信息学筛选检测靶标并分析抗原表位结构,最后成功制备了多克隆抗体,为单增李斯特菌检测靶标的筛选和免疫学检测提供了实践基础。