金雀异黄酮通过减少卵巢切除大鼠心肌小凹蛋白-1的表达而增加一氧化氮的生成

观察金雀异黄酮(genistein)替代治疗对卵巢切除大鼠心肌中一氧化氮(nitric oxide,NO)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)的影响.成年雌性Sprague-Dawley大鼠经双侧卵巢切除术,假手术组作为对照,术后三周将行卵巢切除术的大鼠随机分为低剂量genistein(0.5 mg/kg·d1)、高剂量genistein(5.0 mg/kg·d-1)、17-β雌二醇(0.1 mg/kg·d-1)和模型组(100μl/d芝麻油),各组均皮下注射给药并给予不含大豆的饲料喂养6周,测定大鼠尾动脉血压、心率,麻醉后放血处死大鼠称量子宫重量;放免法检测血浆中总雌二醇,亚硝酸还原酶法检测心肌匀浆中NO,Western blot检测心肌中eNOS的表达以及eNOS的调节蛋白小凹蛋白-1(caveolin-1)和钙调素(calmodulin)的表达情况.结果显示各组间大鼠血压无显著性差异,同17-β雌二醇一样,genistein能呈剂量依赖性地增加心肌组织中eNOS表达量和NO生成,同时genistein能明显降低内源性eNOS活性抑制物caveolin-1的表达,而不影响eNOS活性正性调节蛋白钙调素的表达.与溶媒对照组比较,0.5 mg/kg·d-1的genistein不增加子宫重量,5.0 mg/kg·d-1的genistein增加子宫重量3倍,但较17-β雌二醇(增加6倍)的作用小(P＜0.01).上述结果提示,植物雌激素genistein剂量依赖性地上调心肌组织eNOS的活性并增加NO的生成,减少抑制eNOS活性的小凹蛋白-1表达.     

布氏鲳鲹VEGFA基因克隆与组织表达分析

血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)主要生理功能是增加小静脉血管与微血管的通透性,是血管生成过程最重要的正向调控因子。本研究采用RACE技术克隆布氏鲳鲹VEGFA基因和实时荧光定量PCR方法对该基因进行组织分布表达分析。结果显示,该VEGFA基因cDNA序列全长1 470 bp,5’UTR、3’UTR长度分别为617 bp和208 bp,ORF为645 bp,共编码214个氨基酸,其中包括一个信号肽和两个N-糖基化位点。理论分子量为25.23 kD,等电点为8.91。同源性分析结果表明,布氏鲳鲹VEGFA基因与同属鲈形目鱼类高体鰤的同源性最高(96.1%)。荧光定量PCR分析显示,VEGFA在布氏鲳鲹组织中均有表达,其中肝脏表达水平最高,其次是心脏,在小脑、胃、肠表达较低,在肾脏组织中的表达量最低,说明布氏鲳鲹VEGFA基因在生理代谢以及血管生成过程中可能发挥重要调节作用。本研究结果为深入研究布氏鲳鲹VEGFA基因的生理代谢调控功能提供理论依据。     

miR-195/VEGFA信号通路对脑梗死后血管生成的影响

为了揭示miR-195/VEGFA信号通路对脑梗死后血管生成的影响,本研究测定了大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠脑中的miR-195表达,以及miR-195对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein vascular endothelial cell, HUVEC)的细胞侵袭和血管形成的影响。此外,检测了miR-195对血管内皮生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)表达的影响。研究显示,MCAO组大鼠中miR-195表达显著下调。缺氧处理可导致HUVEC中miR-195表达显著降低。miR-195的下调促进了HUVEC在缺氧条件下的血管生成和细胞侵袭。miR-195模拟物处理可显著下调VEGFA m RNA和蛋白质表达水平。VEGFA的过表达逆转了miR-195过表达对细胞侵袭和小管形成的抑制作用。研究表明miR-195通过靶向VEGFA在缺氧条件下调节脑梗死后的血管生成。     

大鼠睾丸内皮型一氧化氮合酶表达的增龄变化

为研究雄性大鼠睾丸在发生、发育和衰老过程中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在生精功能中的作用及其变化规律，本实验采用了免疫组织化学染色及体视学图像分析等方法，对生后1d至生后24月龄大鼠睾丸eNOS表达的变化进行了系统研究，并统计测量了阳性血管内皮细胞及间质细胞面密度的变化。结果表明：生后1d至2周龄eNOS阳性表达极少；3周龄血管内皮细胞、间质细胞及精子细胞均出现了阳性表达；1月龄至18月龄生精小管靠近管腔的精子细胞也呈阳性，阳性血管内皮细胞、间质细胞数目差异显著；24月龄血管内皮细胞、间质细胞eNOS大量表达，部分生精细胞也有表达。本结果提示一氧化氮参与精子的生成及睾酮的分泌过程，衰老时eNOS阳性表达显著增加，这种变化可能会抑制睾酮的分泌，最终会影响睾丸的生精功能[动物学报49(3)：339—345，2003]。     

水通道 AQP1 敲除小鼠肿瘤血管生成障碍及肿瘤生长减缓

血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的必要步骤. 肿瘤血管生成涉及瘤旁组织血管内皮细胞增殖、向肿瘤细胞团内迁移以及管腔形成,目前机理尚不完全清楚. 水通道 AQP1 在多种肿瘤血管内皮高表达,提示其可能参与肿瘤血管的生成过程. 应用 AQP1 敲除小鼠荷瘤实验证实了 AQP1 在黑色素瘤生长和血管新生中的作用. 结果表明,皮下接种的黑色素瘤在 AQP1 敲除小鼠的生长较之在野生型小鼠延迟近 30％ (P<0.01). 免疫组化与肿 瘤病理形态学分析显示, AQP1 在野生型小鼠黑色素瘤血管内皮细胞上高表达,而在 AQP1 敲除小鼠黑色素瘤血管内皮细胞呈阴性表达. 在病理结构上,黑色素瘤细胞围绕血管分支呈岛状分布. 野生型小鼠黑色素瘤内血管管腔较细小,而 AQP1(－/－)小鼠黑色素瘤内血管床显著膨大. AQP1(－/－)小鼠肿瘤内平均微血管密度 (47/mm²) 较之 AQP1(＋/＋) 肿瘤 (142/mm²) 减少 67％ (P<0.01). 围绕 AQP1(－/－) 肿瘤血管的肿瘤细胞岛周边坏死区域明显大于 AQP1(＋/＋)肿瘤. 上述结果提出确切证据表明, AQP1 缺失使肿瘤血管生成发生障碍,从而影响了肿瘤血液供应和肿瘤生长. AQP1参与肿瘤血管生成的机理值得深入研究.     

AIBP基因表达下调促进心肌微血管内皮细胞血管新生

目的:探讨阻断载脂蛋白A-I结合蛋白(AIBP)的表达后对心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生的作用。方法:消化法分离SD大鼠CMECs,通过慢病毒介导的siRNA转染CMECs下调AIBP基因表达,并设立空白对照组及阴性转染组。RT-PCR法检测AIBP基因的表达;CCK-8比色法检测细胞增殖;Transwell小室评价细胞迁移能力;成管实验评价血管新生能力。结果:RT-PCR结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs中AIBP表达显著降低(P0.01);CCK-8结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs增值水平显著增高(P0.01);Transwell法结果显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs迁移能力显著增高(P0.01);成管实验显示,与空白对照组及阴性转染组相比,转染组CMECs成管能力显著增高(P0.01)。结论:抑制AIBP表达可以明显促进CMECs增殖,促进其迁移和成管。     

TGF-β1激活肝星状细胞并促进血管内皮细胞新生血管形成

该研究旨在探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活中的机制以及活化HSCs促进内皮细胞血管新生(angiogenesis)的作用效果。运用q RT-PCR检测α-SMA、Smad2/3、VEGFA和TGF-β1-RI的m RNA水平;Western blot检测α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3、VEGFA和TGF-β1-RI的蛋白质水平;基质胶(matrigel)血管形成实验检测活化HSCs的促人脐静脉血内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管形成作用。TGF-β1作用后的HSCs高表达α-SMA以及经典的TGF-β1/TGF-β1-RI/Smad2/3信号通路下游相关的TGF-β1-RI和Smad2/3等,具备了活化表型并能促进内皮细胞血管新生。结果表明,TGF-β1信号通过经典的Smad2/3通路激活了HSCs,使激活后的HSCs通过分泌VEGFA具备了促进内皮细胞血管新生的功能。     

TGF-β1信号在成纤维细胞促血管生成中作用的研究

该研究旨在探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)信号在成纤维细胞促血管生成中的作用。实验通过ELISA检测了Hepa1-6细胞上清液中TGF-β1的含量。将胎鼠成纤维细胞分三组,分别用普通培养液(DMEM/F12组)、含Hepa1-6细胞上清液的条件培养液(Hepa1-6组)以及加入1μmol/L TGF-β1受体抑制剂(GW788388)的条件培养液(GWHepa1-6组)培养。采用免疫荧光双染法、q PCR检测培养的成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的蛋白质及m RNA表达水平。采用基质胶(Matrigel)血管形成实验检测成纤维细胞上清液作用下EA.hy 926细胞的血管形成能力。ELISA结果显示,与DMEM/F12相比,Hepa1-6细胞上清液中TGF-β1表达量明显升高(P0.01)。免疫荧光双染法和q PCR结果显示,与DMEM/F12组和GWHepa1-6组比较,Hepa1-6组成纤维细胞中α-SMA和VEGFA蛋白质及m RNA相对水平明显增加(P0.01),且在第5 d时达最高,其上清液诱导EA.hy 926细胞的血管形成能力明显增强(P0.01)。该研究表明,TGF-β1信号通路可以诱导成纤维细胞α-SMA和VEGFA的表达,进而促进EA.hy 926细胞形成小管样结构。     

内含子源性microRNA对内皮型一氧化氮合酶表达及血管内皮细胞增殖的作用

前期工作表明,内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)第4内含子中的27碱基 (nucleotide,nt)重复序列是27-nt microRNA的来源,并对eNOS具有重要的调节作用．为进一步探讨该内含子源性27-nt microRNA参与调节eNOS表达的分子机制及其在内皮细胞增殖中的可能作用,通过构建27-nt microRNA高表达质粒,用脂质体将该质粒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),Western blot和RT-PCR检测该细胞系中eNOS蛋白和mRNA表达情况以及胞核转录因子的表达改变,并观察HUVEC增殖的变化情况．结果发现：27-nt microRNA 高表达能降低eNOSmRNA的水平和蛋白质表达;同时对转录因子Sp1、Ap1的蛋白质表达也产生了不同程度的抑制作用;转染后细胞的生长速度比未转染的细胞明显减慢,尤其转染了27-nt microRNA的双倍长度突变体(pEGP-mut-54nt-mi)质粒的HUVEC,其生长倍增时间比正常对照组明显延长达49.4%．结果表明,27-nt microRNA明显抑制eNOS蛋白及其mRNA表达,同时 HUVEC增殖受到明显抑制,转录因子Sp1 和Ap1 在27-nt microRNA对eNOS的表达调节中起重要作用．实验提示,内含子源性microRNA与转录因子共同参与对内皮细胞增殖及其相关性基因的表达调节,可能是众多真核细胞中某些疾病相关性基因表达自我调节的重要机制之一．     

人参皂甙Rg1抗OxLDL诱导内皮细胞凋亡及分子机制

目的 探讨人参皂甙Rg1抑制氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,OxLDL)诱导血管内皮细胞凋亡的作用及其相关分子机制。方法 以体外培养的牛主动脉内皮细胞为模型。分别加入OxLDL200μg/ml(OxLDL组）和OxLDL200μg/ml Rg140μg/ml（Rg1组）;对照组不加任何诱导物,培养24小时后观察细胞形态变化,DNA电泳,TUNEL染色检测细胞有无凋亡及凋亡的程度,Western blot分析各组内皮细胞型一氧化氮合酶（endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)的表达水平。结果 （1）对照组和OxLDL组血管内皮细胞凋亡比例分别为8%和41.35%;(2)Rg1组血管内皮细胞凋亡比例为13.29%;(3)OxLDL抑制牛主动脉内皮细胞的eNOS表达水平,此抑制作用具有剂量依赖性。人参皂甙Rg1可使被OxLDL抑制的eNOS表达水平回升。结论 （1）OxLDL能诱导血管内皮细胞凋亡。（2）人参皂甙Rg1能抑制OxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡。（3）此作用可能与上调内皮细胞的eNOS水平,减轻细胞的脂质过氧化损伤有关。     

神经纤毛蛋白-1的研究进展

神经纤毛蛋白-1(neuropilin 1,Nrp1)是单次跨膜受体,属于Neuropilin家族。它是神经轴突导向因子3(semaphorin 3,Sema3)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)的特异性受体,既可调节神经系统中轴突的生长、导向和迁移,又与心血管系统的血管新生、病理性血管损伤的修复有关。另外,有大量研究表明Nrp1对肿瘤的发展起重要作用,提示Nrp1是肿瘤治疗的潜在靶点。最近,有研究发现Nrp1与肥胖诱导的胰岛素抵抗和脓毒症相关,揭示其在急、慢性炎症中的作用。我们在本文中综述了Nrp1的研究进展,以期更好的理解Nrp1在生理和病理情况下的功能。     

miR-138转录可下调p33ING1在衰老细胞中的表达

p33ING1参与了多种生物学过程,包括细胞生长抑制、凋亡、DNA损伤修复、染色质重塑等．近来研究显示,p33在细胞衰老过程中表达降低,这可能与衰老细胞的抗凋亡有关．但p33在衰老细胞中表达下调的分子机理仍不清楚．我们发现,在衰老细胞中miR-138表达升高与p33基因的表达降低密切相关．以下实验结果支持如此结论：(1)与年轻细胞相比,带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性在衰老细胞中降低;突变3′UTR上的miR-138结合位点可升高报告载体荧光素酶在衰老细胞中的活性;(2)在衰老细胞中miR-138的表达升高;(3)在年轻细胞中,过表达miR-138不仅可抑制带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性,而且下调细胞内p33ING1基因mRNA和蛋白水平.与此相反,抑制miR-138活性可升高带p33ING1 3′UTR 报告载体荧光素酶活性,并且上调细胞内p33ING1基因mRNA和蛋白水平．这些结果表明,p33ING1基因是miR-138的靶基因;在衰老过程中,miR-138表达升高, 由此导致该基因的表达降低．     

miR-138-5p靶向缺氧诱导因子1α对胰腺癌PANC-1细胞生长和转移的调节作用

目的探索miR-138-5p对胰腺癌细胞PANC-1生长、转移的影响及其相关机制。方法应用荧光实时定量PCR (real-time quantitative PCR, RT-PCR)检测miR-138-5p及其缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha, HIF-1α)在PANC-1细胞中的表达。应用荧光素酶报告检测验证miR-138-5p与HIF-1α之间的生物学关系。通过体外试验研究miR-138-5p、HIF-1α在PANC-1细胞中的生物学功能,Western blot检测蛋白表达情况;CCK-8检测PANC-1细胞增殖能力;Transwell试验检测PANC-1细胞侵袭能力;划痕试验检测PANC-1细胞迁移能力。结果 miR-138-5p表达明显下调HIF-1α表达水平(P<0.01),生物信息学预测和荧光素酶报告试验证明miR-138-5p通过直接结合HIF-1α 3′-未翻译区域(3′-UTR)抑制HIF-1α。在PANC-1细胞中,miR-138-5p过表达可抑制HIF-1α表达及细胞增殖、侵袭、迁移,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论 miR-138-5p结合HIF-1α 3′-UTR的沉默HIF-1α;miR-138-5p通过打靶HIF-1α而抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖和转移。HIF-1α可能是胰腺癌的治疗靶点。     

活细胞内人AGTR1-3′UTR的荧光标记及应激定位分析

利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构(含有MS2蛋白结合位点)的RNA之间的高度亲和力,对外源性人血管紧张素1型受体(angiotensin II receptor type 1,AGTR1)mRNA 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段进行红色荧光标记,进而在活细胞(HeLa)内研究该mRNA片段的应激生物学行为。通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3′UTR和24×MS2,构建重组质粒pSG5/AGTR1-3′UTR/24×MS2,并将该质粒与重组质粒pERFP/MS2和pEGFP/C1-G3BP共转染入Hela细胞。荧光显微成像结果显示,AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆,而且在亚砷酸盐刺激下,红色荧光标记的AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP-GFP共定位的颗粒。该结果表明,针对AGTR1-3′UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功,该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号。在细胞受到氧化应激时,AGTR1-3′UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中,启示了AGTR1-3′UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用。     

团头鲂nanos3基因的克隆鉴定

为了标记团头鲂(Megalobrama amblycephala)的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells, PGCs), 首次克隆并鉴定了团头鲂nanos3基因(mananos3)。mananos3全长1027 bp, 包括48 bp 5′UTR (5′untranslated Region), 490 bp 3′UTR和489 bp开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)。该基因编码162个氨基酸。通过序列比对发现Mananos3蛋白和其他物种Nanos蛋白一样, 存在一个保守的RNA结合功能域, 该功能域包含一个锌指基序(Motif)。系统发育树结果显示, Mananos3与鲤(Cyprinus carpio)的Nanos3最为相近。半定量和定量PCR结果表明, mananos3具有较高的母源表达, 并在胚胎发育早期高量表达, 而在1000细胞期之后表达量逐渐降低。在成体组织中, mananos3仅在卵巢中检测到表达。mananos3和斑马鱼(Danio rerio) nanos3 (zfnanos3)的3′UTR均可以介导绿色荧光蛋白特异标记团头鲂和斑马鱼胚胎发育早期的PGCs, 但是mananos3的3′UTR能够更特异地标记团头鲂的PGCs。通过比对mananos3和zfnanos3的3′UTR发现, mananos3 的3′UTR中有一个非经典的miR430识别位点(GCACTA)。通过对该位点的突变研究证实其有利于nanos3在非PGCs组织中的降解。综上所述, 团头鲂mananos3的3′UTR序列中的非经典miR430识别位点(GCACTA)可能与介导报告基因在PGCs中特异表达相关。     

神经生长导向因子SLIT2抑制结肠癌细胞迁移的作用研究

目的:研究SLIT2基因对结肠癌细胞迁移能力的影响。方法:通过western blot技术检测SLIT2在各种结肠癌细胞系中的表达,采用小干扰RNA转染技术,在低转移细胞系RKO中沉默SLIT2基因表达,并采用PCR和western blot技术验证其干扰效率。采用质粒转染技术,在高转移细胞系LOVO中上调SLIT2基因表达后,通过Transwell迁移实验和划痕愈合实验检测SLIT2表达变化对结肠癌细胞系迁移能力的影响。结果:SLIT2在高转移细胞系LOVO和HCT116中表达明显低于低转移细胞系RKO和HT-29。在低转移细胞系RKO中敲减SLIT2后,Transwell结果显示细胞的迁移能力得到了明显增强(P0.05)。在高转移细胞系LOVO中过表达SLIT2后,细胞的划痕愈合能力和迁移能力则均受到明显抑制(P0.05)。结论:神经生长导向因子SLIT2的表达与结肠癌细胞的迁移潜能相关,体外实验表明SLIT2可抑制结肠癌细胞系LOVO、RKO的迁移能力。     

瑞氏木霉EGⅠ3′-UTR对基因在酿酒酵母中表达的影响

将纤维素降解菌丝状真菌瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ (EGⅠ )全长cDNA克隆于酿酒酵母H1 58中得到表达。重组酿酒酵母产生的EGⅠ的最适pH值为 5 0 ,最适作用温度为 50℃～ 60℃。EGⅠcDNA中的 3′ 非翻译区 (3′ UTR)序列的删除导致EGI基因在酵母菌中没有活性产物表达。通过RT PCR技术检测EGⅠmRNA转录水平的结果表明 ,带有 3′ UTR的EGⅠcDNA在酿酒酵母中具有明显的转录产物生成 ,但删除 3′ UTR之后的EGⅠcDNA却检测不到转录产物。这说明EGⅠ的 3′ UTR对基因在酵母菌中的表达具有重要作用。     

miR-638抑制尤文肉瘤细胞的增殖和血管拟态形成的影响

该研究旨在探讨miR-638在尤文肉瘤细胞中的表达及其对尤文肉瘤细胞增殖和血管拟态形成能力的影响,进一步探讨其可能机制。应用q RT-PCR检测miR-638在尤文肉瘤细胞系(A673、SK-ES-1和RD-ES)中的表达;转染人工合成miR-638 mimic到RD-ES和SK-ES-1细胞内,运用CCK-8法和小管形成实验分别检测miR-638对A673和SK-ES-1细胞增殖及血管拟态形成能力的影响;应用q RT-PCR和Western blot探讨对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGFA)在A673细胞内是否为miR-638的靶基因,回复实验验证VEGFA是否参与miR-638对A673细胞增殖和血管拟态形成的作用。结果表明,与人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)相比,尤文肉瘤细胞内miR-638呈低表达趋势(P0.05);转染miR-638 mimic后,RD-ES及SK-ES-1细胞内miR-638升高明显,表明miR-638 mimic转染成功;转染miR-638组尤文肉瘤细胞增殖能力下降(P0.05),新生拟态血管分支数较对照组减少(P0.05);转染miR-638组A673和SK-ES-1细胞内VEGFA m RNA及蛋白质水平均明显下降,提示miR-638能够调控尤文肉瘤细胞内VEGFA的表达;回复实验结果显示,同时转染了miR-638 mimic和pc DNA-empty组细胞内VEGFA的蛋白质水平最低,生长速度最慢,小管形成的分支数最少。miR-638在尤文肉瘤细胞中呈低表达,过表达miR-638能够抑制尤文肉瘤细胞增殖及血管拟态形成,该作用可能通过靶向调控VEGFA作用而实现的。     

转录因子GATA3 mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点的活性

GATA3(GA-TA-binding protein-3)是锌指蛋白GATA家族成员之一,在细胞的增殖和分化中起着重要的作用,GATA3在细胞中的异常表达也是导致众多肿瘤形成的原因。通过对GATA3m RNA 5′非翻译区(untranslated region,UTR)进行分析,发现其UTR长达557 bp并且具有复杂的二级结构。将GATA3 m RNA 5′UTR克隆至双荧光素酶报告载体p RL-FL中,瞬时转染至细胞中然后对细胞进行无血清培养后,发现GATA3 m RNA 5′UTR介导的翻译明显升高。将GATA3 m RNA 5′UTR克隆至Δp RL-FL载体上,瞬时转染细胞后检测萤火虫荧光素酶的表达,发现GATA3 m RNA 5′UTR不具有隐含启动子,进而确定GATA3 m RNA 5′UTR具有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)元件;进一步对GATA3 m RNA 5′UTR进行序列截短分析,发现GATA3 m RNA 5′UTR中345~557 bp区间可能是抑制IRES活性的调控元件,而95~344 bp区间则是IRES元件的主要活性中心调控域,并且在不同的细胞系中GATA3 IRES元件的活性存在显著的差异。该研究结果表明,GATA3m RNA的5′UTR可参与GATA3的表达调控。     

大鼠Cacnb1报告基因载体构建及miR-16靶向验证

子宫平滑肌过度收缩可导致原发性痛经。钙通道在子宫平滑肌收缩过程中起关键作用,钙通道电压依赖性β1蛋白(voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-1,CACNB1)是其主要组成部分。为探讨mi R-16在子宫平滑肌细胞收缩过程中的调控功能,需验证大鼠Cacnb1基因是否为mi R-16的靶基因。首先,设计特异性引物,扩增大鼠Cacnb1基因3′UTR序列,将扩增片段克隆到pmi R-RB-REPORTTM双荧光素酶报告基因载体,同时构建大鼠Cacnb1基因3′UTR突变的载体;随后,包含正常Cacnb1基因3′UTR序列的载体和突变后的载体分别与mi R-16 mimics共转染293T细胞,检测相对荧光素酶活性变化。结果发现,mi R-16 mimics能够通过结合大鼠Cacnb1基因3′UTR序列显著抑制荧光素酶活性(n=3,P0.001),而对大鼠Cacnb1基因3′UTR突变后的荧光素酶活性无抑制作用。因此,mi R-16能够负向调控大鼠Cacnb1基因的表达,故大鼠Cacnb1基因是mi R-16的靶基因。