徐州医学院病原生物学与免疫学教研室

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性。结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性。结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础。     

玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

小鼠Daintain/AIF-1基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

目的：对Daintain/AIF-1（大炎肽/同种异体移植炎症因子-1）基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法：提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果：PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5＇端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1（pGL3-Basic-DT）载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论：Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

小鼠Daintain/AIF-1 基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因 载体的构建

目的:对Daintain/AIF-1(大炎肽/同种异体移植炎症因子-1)基因启动子进行克隆并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究Daintain/AIF-1的转录调控作用提供了质粒资源。方法:提取单核巨噬细胞系RAW264.7基因组DNA,以其为模板采用PCR方法克隆出Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列,将该序列同源重组到pGL3-Basic载体上,转化感受态DH5α并酶切鉴定和测序。结果:PCR产物片段与预期结果一致,Daintain/AIF-1基因5’端UTR区1.6 kb DNA序列连接到pGL3-Basic载体上,构建成pGL3-Basic-Daintain/AIF-1(pGL3-Basic-DT)载体,酶切结果与理论预测值一致,经测序证实无碱基突变。结论:Daintain/AIF-1基因报告基因载体的构建为进一步研究Daintain/AIF-1转录调控作用提供了载体资源。     

种子特异性启动子（napinB promoter）分离，表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子,序列分析表明,扩增片段（nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97％,将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草,PCR,Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA,获得了转基因植株。     

含PR启动子的原核高效表达载体的构建及应用

组建了一个仅含P_R启动子的原核高效表达载体pRC,它同时含有cⅠ调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列.现已成功地用于表达重组人肿瘤坏死因子-α（hTNF-α）、重组人白细胞介素-3（hIL-3）和抗溶菌酶（HEL）抗体Fd基因,表达量均占菌体总蛋白的36％以上.同时还研究了不同的宿主菌和原核增强子序列等因素对P_R启动子载体表达的影响.此外,还比较了分别以P_R、P_L或P_RP_L作为启动子时表达hTNF-α的情况,结果表明,单用P_R或P_L启动子可获得与使用P_RP_L串联启动子一样的高效表达.     

T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究

人低密度脂蛋白（LDL）受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因（CAT）及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT．两个重组质粒转化CHO细胞．PCR和CAT酶实验显示：两个基因被T7噬菌体启动子所启动．结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因．常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体．     

水稻OsGSTL1启动子的分离和表达分析

从水稻基因组文库中筛选得到一个水稻GST基因,命名为OsGSTL1.半定量RT-PCR分析表明OsGSTL1基因的表达不受绿磺隆、乙烯利、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯的诱导,因此该基因可能与植物抗逆性无关.为了研究OsGSTL1启动子在植物体内的表达特性,将OsGSTL1起始位点5＇端上游不同长度的调控序列与报告基因GUS融合,并在洋葱表皮瞬间表达和拟南芥中稳定表达.研究表明：在洋葱表皮细胞中,160bp及更长的上游调控序列均能启动GUS基因的表达;而在转基因拟南芥中,含有2155 bp的上游序列的PGZ2.1：：GUS具有时空表达的特性,在转基因的早期幼苗中GUS基因在子叶中特异性表达,但在根中没有表达;而在幼苗生长的后期,根、茎、叶中都有少量的表达.但包含1 224 bp的上游序列的PGZ1.2：：GUS却表现为组成型表达的特性.由此推测,OsGSTL1启动子启动的基因表达可能与幼苗的营养代谢相关;而OsGSTL1启动子的时空表达相关元件可能位于OsGSTL1翻译起始位点5＇端上游-2155 bp至-1224 bp范围内.     

增强型肿瘤特异性启动子介导CDTK治疗肝癌的体内外研究

目的:探讨运用增强子上调肿瘤特异性启动子h TERT转录活性后,调控自杀融合基因CDTK对人肝癌细胞系Bel-7402的体内外杀伤作用。方法:将CMV增强子、h TERT启动子及CDTK自杀融合基因克隆入核糖体基因区打靶载体p Hrn,构建p Hr-Ce Tp CDTK-GFP治疗载体并转染Bel-7402细胞,经RT-PCR、HPLC、MTT检测CDTK基因的表达和对肝癌细胞的体外杀伤效果。再将Bel-7402细胞接种到裸鼠皮下致瘤,以肿瘤杀伤载体p Hr-Ce Tp CDTK-GFP进行瘤内转染并检测其抑瘤效果,此外将转染后的细胞接种致瘤,检测其成瘤时间及肿瘤生长曲线等,从两方面检测其体内杀伤效果。结果:成功构建了肿瘤特异性治疗载体,体外转染肝癌细胞后,经RTPCR、HPLC证明CDTK基因能在肝癌中表达,且治疗载体在体外对肝癌细胞有明显毒性。动物实验结果发现裸鼠致瘤后治疗组血清中5-Fu浓度为7.694μg/ml,治疗组肿瘤体积与对照组相比减小6.5倍。而细胞转染治疗载体后致瘤,治疗组成瘤时间比对照组晚8天,且治疗组裸鼠的平均生存期较对照组延长16天。结论:p Hr-Ce Tp CDTK-GFP载体能在体内外高效靶向杀伤肝癌细胞,为肝癌基因治疗提供了一种新的途径。     

AtSTP3启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异表达研究

利用PCR技术从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中分离了AtSTP3绿色组织特异表达的启动子,序列分析表明,扩增片段(1774bp)与已报道序列的相应区域同源性达99.9%。将其与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并由农杆菌介导法导入水稻品种‘中花11’中。对转基因水稻植株中的GUS活性进行定性与定量测定结果表明,AtSTP3启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中特异性表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,AtSTP3启动子表现出明显的组织特异性。     

六倍体大小麦tritordeum花药组织特异性启动子的鉴定与分离

启动子是基因表达调控的重要顺式元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。一个无启动子的带有UidA基因的质粒pPLGUS通过基因枪转化进tritordeum材料中,对转基因材料的多种不同组织进行了X-gluc显色来检测不同组织中的GUS活性,有一个株系的花药组织特异性启动子已被证明成功捕获,并通过PCR方法将其分离。提取叶片的总DNA作模板,上游使用水稻花药启动子分离的引物P1,以UidA基因的部分序列为下游引物P2,PCR扩增UidA基因的上游旁侧序列。已经获得一条长667 bp的目的片断,含有部分UidA基因的序列和一段UidA基因的上游旁侧序列,该序列中具有植物启动子的一些必备元件,初步断定它是一段花药组织特异性启动子序列。     

香蕉凝集素基因启动子的分离、序列分析及鉴定

香蕉是世界上最重要的水果之一,由于香蕉果实是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在香蕉果实中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,果实特异性表达启动子的获得是香蕉作为生物反应器的前提。香蕉凝集素是一种在香蕉果实中大量存在的蛋白质,其基因被证明在果肉组织中大量表达。利用染色体步移法克隆到香蕉凝集素基因5′端上游的一段长702bp的序列,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子,构建植物表达载体,命名为pBIL2,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化香蕉的根、叶和果实薄片,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的凝集素基因启动子,只在香蕉果肉中瞬时表达,该启动子的表达具有果实特异性,并且表达量较高。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达

Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ是单链尿激酶 (Ｓｃｕ ＰＡ)分子的Ｎ端肽段被水解后的产物 ,其分子量小但具有与Ｓｃｕ ＰＡ相同的体内外生物活性[1] 。在过去的工作中 ,本实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到 1株对人纤维蛋白特异的鼠源单链抗体[2 ] ,并构建了鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体—Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ融合基因。为解决该融合基因在大肠杆菌中的高表达问题 ,通过在大肠杆菌中表达构建的一系列融合基因的缺失突变体 ,初步认定Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ基因中两个连排的大肠杆菌稀有密码子ＡＧＧ(精氨酸 )是影响该融合基因表达的主要因素。用ＰＣＲ定位诱变法…     

载有磷酸甘油激酶基因启动子的新表达载体的构建以及在发酵性丝孢酵母中启动外源基因的表达研究

利用简并PCR技术从一株丝孢酵母(Trichosporon sp.)中克隆到磷酸甘油激酶基因的部分序列,然后利用染色体步移的方法克隆到了已知片段的上游序列约950bp。通过启动子序列分析软件分析,发现序列中含有启动子所需的必须元件如TATA BOX和CAAT BOX等,因此确定克隆到的基因片段含有启动子序列。将潮霉素基因置于该启动子下构建了丝孢酵母整合型表达载体pTFPH,并转化发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),转化后的酵母能够在含有潮霉素的抗性选择性平板长出,而未进行转化的对照菌株则不能生长。以上试验证明:丝孢酵母的磷酸甘油激酶基因启动子具有启动异源基因在发酵性丝孢酵母中表达的功能,这个结果为油脂酵母工程菌的构建和开发新的酵母表达宿主奠定了基础。     

启动子探针载体的构建及橡胶树白粉菌启动子筛选鉴定

旨在构建适于快速检测橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)HO-73启动子的探针载体。以卡那霉素抗性基因Kan作为报告基因,在pUC19骨架载体,构建获得启动子探针载体pUC19-K,连入CaMV35S启动子做启动子探针载体功能验证;利用启动子探针载体pUC19-K对预测的启动子片段LY1、LY2、LY3、LY4进行筛选鉴定。将CaMV35S启动子连入到启动子探针载体中,得到可检测启动子活性的启动子探针载体pUC19-K;应用生物信息学软件对部分橡胶树白粉菌HO-73全基因组数据预测,得到4个理论上具有活性的启动子序列LY1、LY2、LY3、LY4,利用构建的启动子活性探针载体进行活性比较,卡那耐受性实验检测发现含LY2和LY3的菌株随卡那霉素浓度的升高耐受性更强,最终得到2个活性较强的启动子LY2和LY3。以上结果表明,构建的启动子活性探针载体可以有效、灵敏地用于HO-73强启动子的筛选和启动子活性检测。     

sgna基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因sgna的现有载体进行了改造,并引入筛选标记基因bar;为提高目的基因的表达水平,在目的基因5′端引入了Ω和kozak序列,3′端引入了poly(A)序列,成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4AGBar和pGBIU4AGBar,基因pGU4AGBar含有顺向连接的Ubi-sgna及Ubi-bar基因表达盒,pGBIU4AGBar含有T-DNA边界序列,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的CaNV35S-nptⅡ,Ubi-sgna和Ubi-bar基因表达盒,人工合成的雪花莲外源凝集素基因sgna可以编码对同翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

一个水稻高效表达启动子Os252的分离

植物基因的表达受启动子的控制,高效表达启动子的分离及功能分析不仅是植物基因工程研究的重要研究方面,也是表达调控研究的重要内容。根据EST数据克隆了一个预测在水稻茎中高效表达的启动子Os252。将该启动子与GUS基因构建成表达载体并转入水稻。转基因水稻PCR分析表明,GUS基因已经成功地整合进水稻基因组中。GUS组织化学分析表明,Os252能启动GUS基因在水稻叶、茎以及胚乳中表达。进一步GUS酶活性的测定表明,叶和胚乳中Os252启动子活性分别是35S启动子的1.9和2.5倍。由于Os252来自于水稻,在叶和胚乳中活性高于35S启动子,因此该启动子可望用于水稻基因工程研究。     

含p27启动子的荧光素酶报告基因的构建和活性测定

目的:克隆p27基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出p27启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性。结果:测序结果显示扩增的p27启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体(ER)α能以剂量依赖的方式升高p27报告基因的转录。结论:克隆了p27启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。