扫描电镜研究呼吸道合胞病毒的融合细胞病变

1977—1979年我们使用国内建株的类淋巴传代细胞(SL)分离培养呼吸道合胞病毒(RSV),证实该株细胞对RSV敏感,可形成广泛典型的融合细胞病变。近几年来又将其使用于RSV的分离培养及中和试验等工作中。1979年曾对     

呼吸道合胞病毒感染不同气道上皮细胞的病变特点及易感性分析

为了比较几种不同气道上皮细胞对呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）感染后病变特点及易感性。采用RSV A2株感染Hep-2、A549、16HBE、BEAS-2B细胞后,奥林巴斯倒置免疫荧光显微镜观察细胞病变效应,免疫荧光检测RSV N蛋白表达及空斑实验测定细胞培养上清液中病毒滴度。结果显示RSV A2株感染Hep-2细胞后最早形成典型的合胞病变,A549细胞次之,16HBE及BEAS-2B形成病变的时间最晚。免疫荧光检测到RSV N蛋白表达特点与细胞病变特点一致。RSV A2在Hep-2上产生的病毒滴度最高,A549细胞次之,在16HBE上产生的病毒滴度最低。提示Hep-2、A549细胞对RSV具有高度易感性,以Hep-2最为敏感。而16HBE、BEAS-2B细胞对RSV感染不敏感,其中16HBE最不敏感。本研究可为选择合适的上皮细胞进行RSV相关研究奠定基础。     

患下呼吸道疾病的婴幼儿合胞病毒的分离

1．国内建株的类淋巴传代细胞(简称SL)分离证实对呼吸道合胞病毒敏感。其敏感性从病毒分离阳性率、病毒增殖滴度和融合细胞病变出现的天数看,与HeLa细胞相似。 2．呼吸遒台胞病毒在SL上所致的细胞病变,为易于辨认的折光性较强的融合病变。融合细胞经染色,胞浆内有典型包涵体,核可由几个至几十个不等。 3．1977年11月到1978年3月从上海市区及郊区县的105例肺炎及气管炎患儿中分离到35株呼吸道台胞病毒。28例症状疑似患儿双份血清,有4倍及4倍以上抗体增长的共15例。     

翻白草油体外抗呼吸道合胞病毒活性研究

目的 研究翻白草油抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用.方法 选取翻白草油进行抗RSV研究,采用细胞病变反应(CPE)和噻唑蓝(MTT)比色法观测翻白草油对RSV作用.结果 MTT和CPE试验结果表明翻白草油在3种作用方式(除细胞保护作用方式)下能够增强宿主HeLa细胞存活率,且细胞存活率与翻白草油浓度呈正相关,翻白草油对宿主HeLa细胞无保护作用,不能阻断RSV病毒进入细胞.结论 翻白草油有抗RSV作用.     

西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒的初步研究

本研究为了解西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)及基因型别。首先采用直接免疫荧光法检测2011年4～7月西藏自治区人民医院儿科病房因急性呼吸道感染住院患儿的鼻咽分泌物标本中7种常见的呼吸道病毒及人类偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)的抗原。然后对RSV抗原阳性的标本分别提取RNA,用逆转录-巢式聚合酶链反应法(Nest-PCR)确定RSV型别,同时用实时荧光PCR(Real-Time PCR)方法进行验证。再通过对G蛋白基因PCR扩增产物序列测定确定RSV的基因型。通过与GenBank中不同地区RSV分离株的G蛋白基因序列比对,了解西藏地区RSV G蛋白的结构特点及变异情况。结果表明,从167例标本中检测出呼吸道病毒抗原阳性的为65例,总阳性率为38.9%(65/167),其中RSV 45例,占阳性标本的69.2%(45/65),对其中42例RSV阳性标本进行了PCR分型,其中40例为A亚型,2例为B亚型。对7株A亚型RSV G蛋白基因PCR产物测序结果显示,全部为GA2基因型。西藏RSV与RSV原型株A2株核苷酸的同源性为90.7%～91.8%,氨基酸的同源性只有86.5%～87.2%。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守序列的两端。7株西藏A亚型RSV G蛋白的核苷酸序列与GenBank中不同的RSV分离株相比同源性为90.7%～91.8%。西藏地区2011年春季小儿急性呼吸道感染的病毒病原主要为呼吸道合胞病毒,A亚型是2011年西藏地区的流行优势型别,其G蛋白胞外区基因具有较高的变异性。     

呼吸道合胞病毒Long株的培养及应用

建立可稳定收获高滴度RSVLong株病毒的培养方法 ,所获得的RSVLong株病毒液用于RSV抗体ELISA检测。RSVLong株病毒 33℃传至 4代后 ,病毒滴度升高 ,出现典型的细胞病变。以RSVLong株病毒液作抗原所建立的ELISA试剂盒能检测出RSV特异性抗体。     

评估首次接种人体的G蛋白缺失RSV减毒活疫苗的安全性、耐受性、脱落性和免疫原性：一项随机对照试验

正人呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿和老年人下呼吸道感染的主要原因。针对呼吸道合胞病毒的儿童疫苗不仅可以预防呼吸道合胞病毒在婴幼儿中的发病和死亡,还可以减少其在老年人群的传播。由一种缺失G附着蛋白的减毒RSV活疫苗组成的RSVΔG与宿主细胞的结合严重受损,在临床前研究中显示其传染性降低。用RSVΔG疫苗对棉鼠进行鼻内免疫可防止野生型RSV的复制,从而不会诱发继发性疾病。作者进行了首次人体试验,     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3’端基因高变区核苷酸序列与RSVGA2亚型的同源性最高。提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSVGA2亚型。     

树鼩呼吸道合胞病毒感染动物模型的建立

探讨用灵长类动物树鼠句建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染动物模型的可行性。28只树鼠句随机分为7组,每组4只,鼻内滴入106PFU RSV,感染后每24h检测1组。另取7只树鼠句鼻内滴入100μl Hep-2细胞培养液,滴鼻后每24h检测1只作对照。无菌取树鼠句肺组织进行病毒分离、空斑形成实验检测病毒滴度、病理检查和RT-PCR检测肺组织内RSV mRNA表达。结果显示:树鼠句感染RSV后,无明显呼吸道感染症状;树鼠句肺组织匀浆接种于Hep-2细胞上,第3、4、5实验组出现细胞病变效应(CPE);树鼠句感染RSV后肺部病理改变在3~7d较为明显,主要为间质改变;在106PFU感染浓度下树鼠句肺组织内RSV处于低水平复制,复制的高峰期在3~5d,峰值在第4d。提示:树鼠句可以用来建立RSV感染的动物模型。     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树.结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3'端基因高变区核苷酸序列与RSV GA2亚型的同源性最高.提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSV GA2亚型.     

1987、1988年春南京地区婴幼儿呼吸道病毒感染病原研究

1987、1988年春南京地区婴幼儿呼吸道病毒感染明显增多,出现两次流行高峰,患儿90％在6个月龄内,3月龄内占65％,临床主要表现为细支气管炎、肺炎。本报告是从门诊及住院117名患儿采集咽分泌物及血液标本,分别进行病毒分离及间接免疫酶组化染色检查,确定两次流行均主要由呼吸道合胞病毒(RSV)感染所致。117份咽分泌物标本,接种Hep—2细胞共分离出29株病毒(阳性率24.8％)。经中和试验鉴定为呼吸道合胞病毒24株(82.8％),3型腺病毒4株(13.8％),腮腺炎病毒1株(3.4％)。29株病毒中25株于接种标本后12天内即出现明显的特征性细胞病变(CPE),最短的仅4天。117例患儿血清标本,酶染色阳性为32侧(阳性率27.4％),与病毒分离比较,两者均阳性者22例,均阴性者83例,符合率89.7％,病毒分离阳性,酶染色阴性者2例(均为发病后第二天入院抽血患儿)。酶染色阳性,病毒分离阴性者10例,表明酶染色法敏感性明显高于病毒分离。     

抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体的制备及其对RSV病毒株抗原性的分析

用呼吸道合胞病毒R6(武汉地方株)活毒滴鼻加用戍二醛固定的病毒感染的Hela细胞免疫BALB/C鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP_2/0细胞融合,培育出分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞13株,这些细胞的染色体数为94至104条,其分泌的抗体分别属于鼠IgC_1、IgG_(2a)、IgG_(2b)亚类。腹水荧光抗体滴度为1:10000～1:100000。其中五株单抗有中和病毒作用,尤其是两株中和放价达1:128。应用免疫转印法证实了这些单抗分别能识别RSV6种主要结构蛋白,用7株识别不同病毒结构蛋白的单抗对12株合胞病毒进行抗原性分析,可将这些病毒区分为二个血清型,即A亚型和B亚型。     

呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1、NS2的研究进展

呼吸道合胞病毒(reespiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染的重要病原体之一.由于该病毒的致病机理还不太清楚导致目前尚无有效治疗RSV的方法.研究表明,呼吸道合胞病毒的非结构蛋白NS1、NS2具有抗细胞凋亡的作用,同时可以逃避宿主免疫系统(IFN)对病毒的干扰,有利于病毒复制.敲除这两种基因的减毒活疫苗和袁达沉默NS1的小干扰RNA(siRNA)的质粒研究已经取得了一定的进展.对非结构蛋白功能的深入研究有助于了解RSV的致病机理,同时为预防和治疗RSV感染奠定理论基础.     

两种单负链RNA呼吸道病毒——流感病毒和呼吸道合胞病毒感染对粘蛋白1表达调控差异的研究

为进一步了解流感病毒(IFZ)是否像呼吸道合胞病毒(RSV)一样在感染过程中可以上调呼吸道上皮细胞粘蛋白1(MUC1)的表达,进而限制炎症的发展。我们利用qRT-PCR和Western Blot检测两种呼吸道单负链RNA病毒感染人呼吸道上皮细胞系——A549细胞后对MUC1的表达调控。分别利用人喉上皮细胞系——HEp-2细胞系和MDCK细胞系培养并收集RSV和IFZ。相同滴度的两种病毒分别感染A549细胞24h后,分别裂解各组细胞,收集总RNA,应用qRT-PCR检测MUC1mRNA的表达情况;或相同滴度的两种病毒分别感染A549细胞24h和48h后,裂解细胞收集总蛋白,同时收集细胞培养上清,应用Western Blot检测MUC1蛋白的表达情况,应用ELISA检测上清中TNF-α水平。结果显示,虽然两种病毒都能上调TNF-α水平,但只有RSV可以上调呼吸道上皮细胞MUC1表达,并呈剂量效应,而IFZ不能上调呼吸道上皮细胞MUC1的表达。本研究首次探讨两种常见呼吸道单负链RNA病毒感染呼吸道上皮细胞后对MUC1表达调控的差异,初步证实临床上IFZ感染后病情自限性的机制不同于RSV感染,与MUC1的表达上调无关。     

以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的人呼吸道合胞病毒F蛋白DNA 疫苗滴鼻免疫抗体分析

[目的]以减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium aroA strain SL7207,SL7207)为载体携带可表达呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial vrius,RSV)密码子优化的融合蛋白(Fusion glycoprotein,F)的真核表达质粒,探讨不同黏膜免疫途径及密码子优化对免疫效果的影响.[方法]通过对RSV野生型F基因(Fwt)进行密码子优化,获得密码子优化的F基因(Fsyn),并构建可表达Fsyn的真核表达质粒pcDNA3.1/Fsyn,转化SL7207得到SL7207/pcDNA3.1/Fsyn.分别经滴鼻和灌胃途径,免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法比较免疫效果.[结果]与灌胃组相比,滴鼻组诱导小鼠产生了更高水平的血清IgG和黏膜SIgA,获得了更好的免疫效果(P＜0.05).与野生型相比,密码子优化的F蛋白具有更好的免疫原性(P＜0.05).[结论]经滴鼻途径免疫和密码子优化能够提高以SL7207为载体的RSV DNA疫苗免疫效果.     

艾叶挥发油抗病毒作用的初步研究

通过微量细胞病变抑制法,初步研究艾叶挥发油对呼吸道合胞病毒(RSV),流感病毒(IFV)的体外抑制作用。从艾叶挥发油的最大无毒量(TD0 )开始,作连续倍比稀释6个浓度,每一浓度均做4孔,分别加入已感染RSV的单层Hela细胞和感染IFV的单层MDCK细胞中,并设立阴性和阳性对照, 37℃,体积分数为5% CO2 培养,连续动态观察,得到药物的半数有效量(IC50 ),并计算治疗指数(TI)。艾叶挥发油对RSV的IC50为3. 33mg·L-1,TI值为9. 4。对IFV没有抑制作用。结论:艾叶挥发油对RSV有一定的抑制作用,对IFV的抑制作用不明显。     

抗生素诱导的呼吸道菌群缺失对小鼠RSV感染的影响

目的探究抗生素雾化暴露引起的呼吸道菌群缺失对小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染的影响,为临床合理使用抗生素提供指导意见。方法32只BALB/c小鼠分为2组:雾化ddH₂O对照组和雾化ABX组合抗生素组,处理6 d后,进行细菌16S rRNA基因PCR检测,构建呼吸道菌群缺失小鼠模型。上述2组组内再随机分为2小组,即PBS对照组(ddH₂O+PBS,ABX+PBS)和RSV感染组(ddH₂O+RSV,ABX+RSV),饲养至第14天。检测和分析各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中的炎症细胞和相关细胞因子(TNF-α、IL-8、IL-10及MCP-1)的数量和水平,观察肺组织病理学状况及检测病毒载量。结果BALF中细菌DNA提取和16S rRNA基因PCR检测显示,雾化ABX组合抗生素处理能够有效地剔除呼吸道菌群。BALF中炎症细胞和相关细胞因子检测显示,ABX+RSV组炎症细胞总数明显增多(P<0.05),分类以巨噬细胞和淋巴细胞为主;且细胞因子TNF-α、IL-8、MCP-1及IL-10水平显著升高(均P<0.05)。肺部HE染色显示,感染RSV后ddH₂O+RSV组和ABX+RSV组小鼠肺部损伤明显加重(均P≤0.01),与ddH₂O+RSV组相比较,ABX+RSV组的病毒载量明显升高(t=2.7160,P=0.0217)。结论雾化ABX组合抗生素不仅能够有效地剔除呼吸道菌群,而且明显增加了小鼠感染RSV的风险,导致呼吸道炎症加重,以及病毒载量升高。     

三叶青对呼吸道合胞病毒作用实验研究

为探讨三叶青在抗病毒中的作用,本文选取三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分,采用细胞病变抑制实验,以治疗指数(TI)为研究指标,研究各溶剂萃取部位、柱分离部分在MA104细胞中对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的抑制作用,从而筛选出三叶青抗RSV有效部位,分离活性成分。三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的TI值分别为128和64,相对于阳性对照药利巴韦林(TI值为6.25)。说明三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和乙酸乙酯萃取部分具有抗RSV的活性且明显优于利巴韦林。     

裸鼠呼吸道合胞病毒感染的动物模型

呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴幼儿下呼吸道感染的首位病毒病原体,免疫缺陷个体容易发生严重感染,目前尚无理想RSV感染动物模型用于研究。我们用细胞免疫缺陷裸鼠感染RSV,旨在建立理想的动物模型,为RSV感染的防治研究奠定基础。裸鼠滴鼻感染RSV后肺组织分离到病毒,直接免疫荧光检测到支气管肺泡灌洗液RSV抗原阳性,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度在感染后第3天达高峰,并持续到第9天仍能检测到病毒。免疫组化检测RSV抗原主要分布在细支气管、毛细支气管和肺泡上皮细胞胞浆内。肺组织病理学显示RSV感染导致裸鼠淋巴细胞浸润为主的肺间质性炎症,电镜分析超微结构可见到细胞内病毒颗粒和气血屏障的破坏。支气管肺泡灌洗液白细胞计数显示裸鼠RSV感染炎症高峰在感染后第9天。裸鼠RSV感染的病毒复制和病理改变特点与人相似,病毒持续高水平复制,是客观而实用的评价抗RSV制剂效果的小鼠模型。     

裸鼠呼吸道合胞病毒感染的动物模型

呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界婴幼儿下呼吸道感染的首位病毒病原体,免疫缺陷个体容易发生严重感染,目前尚无理想RSV感染动物模型用于研究.我们用细胞免疫缺陷裸鼠感染RSV,旨在建立理想的动物模型,为RSV感染的防治研究奠定基础.裸鼠滴鼻感染RSV后肺组织分离到病毒,直接免疫荧光检测到支气管肺泡灌洗液RSV抗原阳性,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度在感染后第3天达高峰,并持续到第9天仍能检测到病毒.免疫组化检测RSV抗原主要分布在细支气管、毛细支气管和肺泡上皮细胞胞浆内.肺组织病理学显示RSV感染导致裸鼠淋巴细胞浸润为主的肺间质性炎症,电镜分析超微结构可见到细胞内病毒颗粒和气血屏障的破坏.支气管肺泡灌洗液白细胞计数显示裸鼠RSV感染炎症高峰在感染后第9天.裸鼠RSV感染的病毒复制和病理改变特点与人相似,病毒持续高水平复制,是客观而实用的评价抗RSV制剂效果的小鼠模型.