鼻咽癌中Epstein—Barr病毒基因结构特点

鼻咽癌中感染的ＥＢＶ以潜伏态存在,只有少数基因得到表达。我们从分子生物学水平研究其潜伏机制。已知ＲＺＬＦ１基因和ＢａｍＨＩＥＺ片段内部分基因对ＥＢＶ的复制激活起关键作用。我们用体外基因扩增（ＰＣＲ）法扩增ＢＺＬＦ１基因外显子－１序列,并用序列分析法研究了该基因结构特点。此外,检测了ＢａｍＨＩＥＺ片段内的基因缺失,结果发现２１例鼻咽癌（ＮＰＣ）组织中,１１例有ＢａｍＨＩＥＺ片段内缺失,长达２．９９ｋ     

鼻咽癌组织中Epstein—Barr病毒潜伏感染膜蛋白基因片段的克隆及分析

从两例鼻咽癌（ＮＰＣ）病人的活检组织切片中,用ＰＣＲ方法扩增出ＥＢ病毒潜伏感染膜蛋白（ＬＭＰ）基因的Ｅｘｏｎｌ、Ｉｎｔｒｏｌ ＥｘｏｎΠ和ＩｎｔｒｏｎΠ共５００ｂｐ的片段,克隆入载体ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）′,测定核苷酸序列,其中有一个样品所测序列段与台湾析相似,另一个样品则与Ｂ９５－８极为相似。由此可知。中国陆南方的ＮＰＣ组织中ＥＢＶ－ＬＭＰ基因存在不同的变异。     

鼻咽癌组织中Epstein－Barr病毒潜伏感染膜蛋白基因片段的克隆及分析

从两例鼻咽癌（ＮＰＣ）病人的活检组织切片中,用ＰＣＲ方法扩增出ＥＢ病毒潜伏感染膜蛋白（ＬＭＰ）基因的ＥｘｏｎⅠ、ＩｎｔｒｏｎⅠ、ＥｘｏｎⅡ和ＩｎｔｒｏｎⅡ共５００ｂｐ的片段,克隆入载体ｐＧＥＭ－３ｚｆ（＋）′,测定核苷酸序列,其中有一个样品所测序列段与台湾株相似,另一个样品则与Ｅ９５－８极为相似。由此可知,中国大陆南方的ＮＰＣ组织中ＥＢＶ－ＬＭＰ基因存在不同的变异。     

鼻咽癌Epstein－Barr病毒受体（EBVR／CR＿2）基因的病毒结合区的序列测定

Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）进入鼻咽上皮细胞的途径,是人们研究ＥＢＶ与鼻咽癌（ＮＰＣ）的病因关系时所必须回答的一个问题。用抗ＥＢＶ受体（ＥＢＶＲ／ＣＲ＿２）单抗检测上皮细胞中该受体的表达已有报道,但对上皮细胞中ＥＢＶＲ／ＣＲ＿２的基因结构仍需研究。我们采用ＰＣＲ扩增和不对称ＰＣＲ直接测序法,首次检测了１０例ＮＰＣ及３例正常人胚鼻咽上皮（Ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｎａｓｏｐａｒｙｎｇｅａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ,ＨＥＮＥ）组织样本中ＥＢＶＲ／ＣＲ＿２的ＥＢＶ结合区的编码序列。这一片段的ＤＮＡ序列测定结果显示,人ＮＰＣ细胞和正常ＨＥＮＥ细胞的ＥＢＶＲ／ＣＲ＿２的ＥＢＶ结合区的编码序列,与正常人Ｂ淋巴细胞的ＥＢＶＲ／ＣＲ＿２的相应序列完全相同,提示ＥＢＶ感染鼻咽上皮细胞可能与ＥＢＶＲ／ＣＲ＿２基因的ＥＢＶ结合区结构改变无直接关系。     

Epstein—Barr病毒基因组在鼻咽癌组织中转录的特征

对ＥＢ病毒基因在鼻咽癌活检组织细胞内的转录进行了较系统的探测。实验结果表明,ＥＢ病毒基因组在鼻咽癌活检组织中以附加体（Ｅｐｉｓｏｍｅ）形式存在,而其基因转录有如下特征：（１）ＥＢ病毒在所有鼻咽癌组织细胞中都表达ＥＢＮＡ－１,并且此基因转录产物由一个在ＢａｍＨＩ－Ｆ区的启动子（Ｆｐ）驱动;（２）潜伏感染膜蛋白（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＬＭＰ）和末端蛋白（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒ     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的 …

以ＰＲＲＳＶ弱毒株膜蛋白（Ｍ）和核衣壳（Ｎ）蛋白基因为模板,设计的一对含有ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点的引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一约９００ｂｐ的ＭＮ基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐＢＶ２２０,构建成重南粒ｐＢＶＭＮ,导入大肠杆菌ＤＨ５α,经温敏诱导,成功地表达了ＭＮ基因。表达产物经ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ印迹分析,其分子量约３４ｋＤ,与兔抗ＰＲＲＳＶ高兔血清     

昆虫杆状病毒衣壳主蛋白基因的PCR扩增,克隆和定位

用ＰＣＲ技术成功地扩增了苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的衣壳主蛋白基因（ｖｐ３９基因）,并克隆了该基因,利用纯的ｖｐ３９基因探针,在低严谨杂交条件下,已将粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ｖｐ３９基固定位在ＰｓｔＩ－Ｆ,ＢａｍＨＩ－Ｃ,ＥｃｏＲＩ－Ｃ,ＸｈｏＩ－Ｄ,Ｉ,ＥｃｏＲＶ－Ｈ,Ｘ等片段上。ＰＣＲ反应时,在扩增出预期的包括完整ｖｐ３９基因的１４０６ｂｐ片段的同时也扩增出一条Ｃａ．４００ｂｐ的片段,本文讨论了ＰＣＲ的特异性扩增和非特异性扩增。     

鼻咽癌Epstein—Barr病毒受体（EBVR／CR2）基因的病毒结合区的序列测定

Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）进入鼻咽上皮细胞的途径,是人们研究ＥＢＶ与鼻咽癌（ＮＰＣ）的病因关系时所必须回答的一个问题。用抗ＥＢＣ受体（ＥＢＶＲ／ＣＲ２）单抗检测上皮细胞中该受体的表达已有报道,但对上皮细胞中ＥＢＶＲ／ＣＲ２的基因结构仍需研究。我们采用ＰＣＲ扩增和不对称ＰＣＲ直接测序法,首次检测了１０例ＮＰＣ及３例正常人胚鼻咽上皮（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅ     

高分化及低分化鼻咽癌细胞株中Epstein－Barr病毒潜伏感染膜蛋白（LMP1）基因的原位杂交与克隆及序列分析

应用染色体原位杂交、ＰＣＲ扩增、克隆及核苷酸序列分析等方法,分析了ＣＮＥ１和ＣＮＥ３细胞株中的潜伏感染膜蛋白（ＬＭＰ１）基因。ＣＮＥ１是来自我国东北的高分化鼻咽癌细胞株,ＣＮＥ３是来自广西的低分化鼻咽癌细胞株。染色体原位杂交结果表明,ＣＮＥ１细胞中ＬＭＰ１基因存在于细胞核内,整合在第一号染色体上,ＣＮＥ３中ＬＭＰ１基因则随机存在于细胞核内及多条染色体上。用ＰＣＲ方法分别从ＣＮＥ１及ＣＮＥ３中扩增得到了ＬＭＰ１基因片段（外显子３）,核苷酸序列分析证明,来自ＣＮＥ１的ＬＭＰ１与来自Ｂ９５－８细胞的ＬＭＰ１核苷酸序列同源性极高,达９９．５％,而ＣＮＥ３的ＬＭＰ１基因与Ｂ９５－８的ＬＭＰ１基因同源性为９３％。     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

孤儿受体TR3与人CNTF受体基因中顺式元件作用机制的研究

应用两对人工合成的寡核苷酸引物,分别通过ＰＣＲ扩增,得到了ＣＮＴＦＲα－Ｉ５ＮＢＲＥ序列两侧的两个扩增片段,将其和在ＥｃｏＲⅤ位点切开的ｐＴ７ｂｌｕｅ一起定向连接,得到了插入在ｐＴ７ｂｌｕｅ的ＥｃｏＲⅤ位点的缺失了ＮＢＲＥ序列的ＣＮＴＦＲα－Ｉ５,然后再将其切下,插入到具有ＳＶ４０起动子的ＣＡＴ基因表达载体的ＢｇｌⅡ位点,构建了ＣＡＴ报道基因．细胞转染和ＣＡＴ实验表明,缺失ＮＢＲＥ后,ＣＮＴＦＲα－Ｉ５仍具有增强子功能,ＴＲ３通过该增强子对ＣＮＴＦＲα的表达具有诱导作用,说明这种诱导作用并不是单一通过ＮＢＲＥ序列进行的．     

马立克氏病病毒（MDV）814株B抗原基因的克隆及部分序列分析

提取感染鸡胚成纤维细胞ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４病毒ＤＮＡ为模板,根据ＲＢＩＢ株ｇＢ基因５′及３′两端核苷酸离列设计引物,利用ＰＣＲ技术扩增了我国ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４ｇＢ基因（２．９ｋｂ）将扩增片段平末端克隆到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中ＥｃｏＲＶ位点,经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与ＲＢＩＢ株ｇＢ基因无差异,显示了极高的     

高分化及低分化鼻咽癌细胞株中Epstein—Barr病毒潜伏感染膜蛋白（LMP…

应用染色原位杂交、ＰＣＲ扩增、克隆及核苷酸序列分析等方面,分析了ＣＮＥ１和ＮＥ３细胞株中的潜伏感染膜蛋白（ＬＭＰ１）基因。ＣＮＥ１是来自我国东北的高分化鼻咽癌细胞株。ＣＮＥ３是来自广西的低分化鼻咽癌细胞株。染色体原位杂交结果表明,ＣＮＥ１细胞中的ＬＭＰ１基因存在于细胞核内,整合在第一号染色体上,ＣＮＥ３中ＬＭＰ１２基因则随机存在于细胞核内及多条染色体上。用ＰＣＲ方法分别从ＣＮＥ１及ＣＮＥ３中扩增到     

EB病毒胸苷激酶基因的定向克隆

采用异硫氰酸胍（ＧｕＳＣＮ）和硅藻从Ｂ９５－８细胞中快速抽摸板ＤＮＡ。根据ＥＢ病毒（ＥＢＶ）Ｂ９５－８株ＤＮＡ全序列及编码ＥＢＶ胸苷激酶（ＴＫ）的开放读框ＢＸＬＦ１的结构,设计合成一对引物,并在引物的５′一端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点,用ＰＣＲ技术扩增出一含完整的ＥＢＶＴＫ基因的１．８４３ＫｂＤＮＡ片段,ＮｃｏＩ酶切分析鉴定,ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切ＰＣＲ产物和载体,使目的基因定向克隆至选     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比     

用PCR技术克隆细小病毒H－1部分非结构蛋白基因

应用ＰＣＲ技术定向克隆了细小病毒Ｈ－１的非结构蛋白（ＮＳ）部分基因片段。自行设计并合成了ＰＣＲ引物△Ｐ３和△Ｐ４,在两个引物中分别引入两个突变碱基,使扩增后的ＤＮＡ片段的两端含有限制性核酸内切酶ＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨＩ的酶切位点,经双酿切法把该ＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１１８质粒中。对插入片段的ＤＮＡ序列测定和分析结果证实该片段为Ｈ－１ＮＳ－１基因序列。以此重组质粒为探针,采用分子杂交的方法,分别测定了Ｈ－１及ＭＶＭＤＮＡ在细胞内的复制水平。这一基因的克隆为制备Ｈ－１的质量监测、Ｈ－１及ＭＶＭＮＳ－１蛋白抑瘤作用机理及其在肿瘤细胞及正常组织中的转录表达等研究奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌cry1A启动子上游区缺失体的研究

利用ＰＣＲ方法，设计相应的扩增引物，以ｐＨＴ／２７２ｕｐ－ｐＳＧＮＵ质粒ＤＮＡ为模板，扩增得到缺失相应序列的上游片段，然后将其连接到ｐＨＴ－ｐＳＧＭＵ穿梭载体的ＢｒＩ－ｌａｃＺ融合基因表达的影响。结果表明，缺失反向重复区，保留弯曲区（ＰＣＲＡ），对ＢｔＩ－ｌａｃＺ融合基因在库斯塔克亚种菌株８０－２１中的表达与完整上游区的增强作用相一致，而在鲇泽亚种中，ＢｔＩ－ｌａｃＺ基因表达量明显比未缺失体低。这     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

大鼠诱导型一氧化氮合酶基因转录调控区的克隆与鉴定

采用单特异引物ＰＣＲ克隆法,得到大鼠诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因转录调控区ＤＮＡ片段。核酸序列分析证实,大鼠ｉＮＯＳ基因的５＇－侧翼区含有ＩＦＮ－γ和ＴＮＦ－α应答元件及ＮＦ－ｋＢ结合位点的保守序列。这些保守序列的位置及排列显区别于人和小鼠的ｉＮＯＳ基因。电泳迁移率改变分析（ＥＭＳＡ）表达,ＶＳＭＣ受ＩＬ－１和ＩＦＮ－γ刺激后,细胞核内产生某种可与ｉＮＯＳ基因５＇－侧翼区特异结合的核蛋白因     

中国棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因的定位与克隆

以α３２ＰｄＡＴＰ标记含ＣｆＭＮＰＶ几丁质酶基因的重组质粒为探针,在６８℃条件下对棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,将ＨａＳＮＰＶ的几丁质酶基因分别定位在ＢａｍＨＩＥ、ＢｇｌⅡＥ、ＥｃｏＲＩＧ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＸｂａＩＨ、ＢａｍＨＩ＋ＨｉｎｄＩＩＭ和ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩＨ,并以ｐＴＺ１９Ｒ为载体获得了ＸｂａＩＨ片段克隆。