重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。     

文昌鱼AmphiSmad 1／5／8和AmphiSmad4的克隆和表达

Smad蛋白是转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员细胞内信号传导蛋白。本研究在青岛文昌鱼中克隆到了两个Smad基因,分别命名为AmphiSmad1／5／8和AmphiSmad4。它们编码的氨基酸序列具有典型的Smad家族蛋白的结构特征,都包含保守的MH1和MH2结构域。进化分析表明,AmphiSmad1／5／8属于R-Smad亚家族的Smad1,Smad5和Smad8亚群。而AmphiSmad4属于Co-Smad亚家族。在文昌鱼的早期胚胎发育中,这两个基因都在脊索、肌节和消化道壁表达,呈腹部化表达模式,推测可能参与文昌鱼背腹轴的形成和分化。另外,在正常文昌鱼成体中这两个基因也在所检测的组织中广泛表达,尤其在脊索和性腺中高表达,提示它们可能在器官的形成中发挥重要作用。     

7型庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因的克隆及原核表达分析

为了探究7型庚型肝炎病毒E2基因编码蛋白作为ELISA试剂盒研发所需检测抗原的可能性,建立更为可靠的GBV-C检测方法,本研究应用在线软件对GBV-C E2基因序列的编码区进行生物信息学分析,预测了E2基因编码蛋白的抗原表位、空间结构及线性B细胞表位等;通过逆转录PCR从7型GBV-C病毒中克隆出E2基因片段,将其克隆到pET-32a载体上,重组载体pET-32a-E2转化大肠杆菌BL21后诱导表达,用12%SDS-PAGE检测,结果重组蛋白主要以包涵体形式存在,其分子量大小约为55kD,利用His标签抗体对重组蛋白进行Western-blotting验证。结果表明GBV-C E2蛋白有多个抗原表位点,克隆的E2基因序列长度为945bp,重组蛋白以包涵体形式表达,其分子量大小与预期一致,此研究为GBV-C检测试剂盒的研制工作奠定了基础。     

斑马鱼心脏发育标记基因Wnt11的多克隆抗体制备

Wnt11为Wnt家族的成员,是参与Wnt信号途径调控的转录因子,对心脏的正常发育起着非常重要的作用.根据已报道的Wnt11基因序列,通过RT-PCR从斑马鱼心脏组织中得到Wnt11部分编码区序列,将其连接到pGEX-4T-1原核表达载体上.经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功,将重组质粒(pGEX-4T-Wnt11)转化E.coli BL2l,通过IPTG诱导表达出融合蛋白,采用谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化.将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Wnt11原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Wnt11多克隆抗体,为Wnt11功能的进一步研究奠定了基础.     

质粒pRSET-A前导肽串联多聚体的构建及其多克隆抗体制备*

质粒pRSET-A是一个常用的高效原核表达载体,编码一N端含组氨酸标签（6×His）的34aa前导肽序列,以方便利用抗组氨酸标签抗体鉴定或纯化所表达的重组蛋白。本实验设计一对两侧含编码疏水性氨基酸密码子的引物,经过扩增前导序列10~34aa基因序列,并重新克隆入质粒pRSET-A构建串联二聚体后,再利用质粒pRSET-A的BamH I / Bgl II同尾酶克隆位点,经一系列简单的酶切和连接,快速构建这一前导肽中不含组氨酸标签序列的串联多聚体基因,并成功表达其六聚体重组蛋白。将此重组蛋白主动免疫山羊,获得了能够特异地识别pRSET-A编码的N端前导肽序列的抗体。结果显示,所制备的羊抗10~34aa前导肽抗体能够识别pRSET-A指导表达的含有完整前导肽的重组蛋白,但不能识别不含10~34aa序列的重组蛋白;同时,利用同位酶技术可以快速高效构建短肽的串联多聚体以制备具有高免疫原性的亚单位疫苗或免疫调控物质。     

果蝇odd蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备研究

odd是一个新发现的心脏特异表达基因。为了进一步研究odd在心脏发育中的功能,根据已报道的odd基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增,将所得的odd部分编码区序列连接到pET-28a载体上构建原核表达载体;重组子经酶切测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,纯化后的His-odd融合蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体活性。结果表明,获得了odd原核表达重组融合蛋白以及高效价的、特异性兔抗Odd多克隆抗体,为后续的odd功能研究奠定了基础。     

人早胚发育相关蛋白ZNF268的抗体制备

目的:获得纯化抗原用于制备ZNF268的多克隆抗体。方法:PCR扩增目的基因片Spacer区序列,亚克隆入融合蛋白表达载体pET28a+,构建了重组质粒pET28a+/SPA。然后将该重组质粒转化E.coliDE3(Rosseta),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分离,获纯化融合蛋白6His-SPA。用6His-SPA免疫家兔,颈动脉取血,分离血清,从血清中获得ZNF268特异的多克隆抗体。结论:通过构建融合蛋白重组表达质粒pET28a+/SPA,用获得的初步纯化融合蛋白6His-SPA,制备了特异的ZNF268的多克隆抗体6His-SPA Ab。     

犬冠状病毒大熊猫株核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达

首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVGP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVGP野毒株进行了RT—PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCV标准毒株Insavc—1N基因相比,核苷酸的同源性为92．6％,推导的氨基酸的同源性为93．2％。在推导的N蛋白N端156—179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc—1株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET8a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IFTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为48KD的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49．3％,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

多疣壁虎tubulin beta3基因克隆和多克隆抗体制备

Tubulin beta3(TUBB3)是特异表达于神经元的微管蛋白tubulin beta家族成员,被认为在维持轴突正常状态起着重要作用,是神经元特异的标志蛋白。该研究旨在获得多疣壁虎TUBB3全长cDNA序列并制备其多克隆抗体,为进一步研究多疣壁虎断尾再生提供基因和抗体工具。根据多疣壁虎中枢神经组织cDNA文库中TUBB3的EST片段序列,采用RACE-PCR方法,获得了全长cDNA,序列全长1790bp,编码450个氨基酸,与其他物种TUBB3蛋白高度同源;RT-PCR方法和Northern blotting检测了TUBB3组织表达谱及其转录本的大小;在GenBank登录号为JQ080315;NJ法构建的系统进化树分析表明,多疣壁虎的TUBB3蛋白与鸡的TUBB3蛋白在进化距离上较近;构建pET-32a-TUBB3原核表达载体,诱导表达并纯化TUBB3蛋白,获得兔抗壁虎TUBB3多克隆抗体,ELISA检测其效价大于1:65536,Western blotting方法证实所制备的多克隆抗体可特异识别多疣壁虎神经组织的的TUBB3蛋白。     

Formation of the chordamesoderm in the amphioxus embryo: Analysis with Brachyury and fork head/HNF-3 genes

 The embryonic development of amphioxus (cephalochordates) has much in common with that of vertebrates, suggesting a close phylogenetic relationship between the two chordate groups. To gain insight into alterations in the genetic cascade that accompanied the evolution of vertebrate embryogenesis, we investigated the formation of the chordamesoderm in amphioxus embryos using the genes Brachyury and fork head/HNF-3 as probes. Am(Bb)Bra1 and Am(Bb)Bra2 are homologues of the mouse Brachyury gene isolated from Branchiostoma belcheri. Molecular phylogenetic analysis suggests that the genes are independently duplicated in the amphioxus lineage. Both genes are initially expressed in the involuting mesoderm of the gastrula, then in the differentiating somites of neurulae, followed by the differentiating notochord and finally in the tail bud of ten-somite stage embryos. On the other hand, Am(Bb)fkh/HNF3-1, an amphioxus (B. belcheri) homologue of the fork head/HNF-3 gene, is initially expressed in the invaginating endoderm and mesoderm, then later in the differentiating notochord and in the tail bud. With respect to these two types of genes, the formation of the notochord and tail bud in amphioxus embryos shows similarity and dissimilarity with that of the notochord and tail bud in vertebrate embryos. Received: 21 November 1996 / Accepted: 24 January 1997     

Pattern of Brachyury gene expression in starfish embryos resembles that of hemichordate embryos but not of sea urchin embryos.

Echinoderms, hemichordates and chordates are deuterostomes and share a number of developmental features. The Brachyury gene is responsible for formation of the notochord, the most defining feature of chordates, and thus may be a key to understanding the origin and evolution of the chordates. Previous studies have shown that the ascidian Brachyury (As-T and Ci-Bra) is expressed in the notochord and that a sea urchin Brachyury (HpTa) is expressed in the secondary mesenchyme founder cells. A recent study by [Tagawa et al. (1998)], however, revealed that a hemichordate Brachyury (PfBra) is expressed in a novel pattern in an archenteron invagination region and a stomodaeum invagination region in the gastrula. The present study demonstrated that the expression pattern of Brachyury (ApBra) of starfish embryos resembles that of PfBra in hemichordate embryos but not of HpTa in sea urchin embryos. Namely, ApBra is expressed in an archenteron invagination region and a stomodaeum invagination region.