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目的:构建莱芜猪肝脏组织全长cDNA文库,以便研究与莱芜猪优良性状相关的基因。方法:采用改良的异硫氰酸酸胍一步法制备总RNA;利用SMART技术,以PrimeScript反转录酶逆转录合成第一链cDNA,通过LD-PCR扩增获得cDNA双链;经蛋白酶K消化和CHROMA SPIN-400柱分级分离后,收集500 bp以上的cDNA片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,建成原始文库;随机挑取单菌落,用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定重组子插入片段大小。结果:经鉴定,原始文库的滴度为2.8×105 cfu/mL,重组率约为98%,插入片段大小为0.5~2 kb,平均插入片段长度大于1 kb。结论:建立的cDNA文库质量良好,可以用于目的基因的筛选。 相似文献
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旨在构建SPF鸡肝脏组织细胞的cDNA文库并且对文库质量进行鉴定。用TRIzol方法从SPF鸡肝脏组织细胞中提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其含量后,应用SMART技术经过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN-400纯化柱纯化得到双链cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化进酵母Y187感受态,以同源重组的方式在酵母细胞内构建鸡肝脏酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,成功构建含有1.70×10~7个重组子的SPF鸡肝脏细胞cDNA文库,插入片段多数在0.4~2.0 kb之间,重组率达100%,重组子中平均插入的片段长度为1.0 kb,文库滴度为1.30×10~7 cfu/mL。结果表明,该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为进一步筛选此文库与ARV相互作用的宿主蛋白以及研究其功能提供了数据依据。 相似文献
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铁皮石斛cDNA文库的构建及分析 总被引:2,自引:0,他引:2
首次报道铁皮石斛cDNA文库的构建及其分析.以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛叶片中提取总RNA,分离纯化mRNA,LD-PCR法反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建铁皮石斛cDNA文库.原始文库的滴度为4.3×105 pfu/mL,总克隆数为3.1×105,重组率为97.6%,扩增后文库总滴度为6.8×109pfu/mL,对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定,结果插入片段多分布在0.5~2.0kb之间,绝大部分在1.2~1.7kb左右,文库质量鉴定结果表明,构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.cDNA文库的构建为铁皮石斛药用成分相关功能基因的研究奠定了基础. 相似文献
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Gateway(R)技术构建交链孢菌JH505 cDNA文库 总被引:4,自引:0,他引:4
Gateway○R技术构建cDNA文库,利用λ噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。首次应用Gateway○R技术构建交链孢菌cDNA文库,经检测cDNA入门文库的滴度达到1×107cfumL,文库总容量为9×107cfu,平均插入片段为1510bp。通过LR重组把入门文库转换为表达文库,表达文库的滴度为1.58×106cfu/mL,文库总容量为6.32×106cfu,平均插入片段大小为1680bp。表达文库的构建为进一步克隆植物激活蛋白基因打下了基础。 相似文献
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中华大蟾蜍精巢组织全长cDNA文库的构建及泛素延伸蛋白基因Bg-ubi52的获得 总被引:4,自引:0,他引:4
运用SMART技术构建了中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)精巢全长cDNA文库。提取中华大蟾蜍精巢总RNA,用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得全长cDNA双链;经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,500bp以上的片段与λTriplEx2载体连接并包装,建成原始文库。经鉴定,原始文库滴度为2.21×106pfu/ml,重组率为91%;文库扩增后的滴度为2.94×109pfu/ml,重组率为93.7%。插入片段大小分布于0.4~2.0kb之间,平均长度约为1.0kb,说明已构建文库质量较高,为进一步筛选、克隆精巢特异表达基因奠定了基础。从该文库中克隆到了泛素延伸蛋白基因,全长561bp,包含完整的5′和3′非编码区,编码128个氨基酸,即泛素的76个氨基酸后融合了52个氨基酸的核糖体L40蛋白。 相似文献
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SMART技术构建栀子cDNA文库 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建栀子叶片cDNA文库。方法:提取栀子叶片总RNA。利用SMART技术合成双链cDNA。双链cDNA经限制酶Sfil酶切后与pDNR-LIB质粒连接。利用电刺激转化法将重组质粒导入E.coli DH5α而获得文库。利用PCR法检测文库的重组率。结果:原始文库滴度为2.63×105cfu/ml。随机检测文库中的15个克隆,表明重组率约为86.7%。选择14个插入片段的长度在400bp以上的克隆进行测序和生物信息学分析,结果预测的全长基因占所检测序列的64.3%。结论:成功构建了栀子叶片的cDNA文库,为栀子基因的结构和功能的研究提供了基础。 相似文献
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目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrapXR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4~3kb,平均长度在0.8kb左右。结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础。 相似文献
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Gateway技术构建交链孢菌JH505 cDNA文库 总被引:5,自引:1,他引:5
Gateway(R)技术构建Cdna文库,利用λ噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割Cdna,能够解决常规方法构建Cdna文库的技术缺陷.首次应用Gateway(R)技术构建交链孢菌Cdna文库,经检测Cdna入门文库的滴度达到1×107cfu/Ml,文库总容量为9×107cfu,平均插入片段为1510bp.通过LR重组把入门文库转换为表达文库,表达文库的滴度为1.58×106cfu/Ml,文库总容量为6.32×106cfu,平均插入片段大小为1680bp.表达文库的构建为进一步克隆植物激活蛋白基因打下了基础. 相似文献
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为了探索金柑花发育的分子机制并研究与金柑花发育相关重要基因编码的蛋白质之间的相互作用,本研究以融安金柑不同生长时期的花蕾为材料,采用SMART技术构建了cDNA文库,对该文库进行了鉴定评价。经检测,所构建的cDNA文库滴度为2.83×10^8cfu/mL,文库库容为1.42×10^10cfu,重组率为97.91%,插入的双链cDNA片段长度主要分布在250~2 000 bp之间。结果表明,该文库达到了建库标准,理论上涵盖了全部与融安金柑花蕾发育相关的基因,为后续利用酵母双杂交技术筛选互作蛋白提供了物质基础。 相似文献
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嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA 文库的构建和亲环蛋白基因序列的初步分析 总被引:1,自引:0,他引:1
实验利用灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导处于四龄池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)14h,将诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA 进行逆转录, 用LD-PCR 法合成双链cDNA, 从而首次成功构建池蝶蚌血细胞的全长cDNA 文库。原始文库的滴度为4106 cfu/cm3, 重组率为90%, 扩增后文库的滴度为3.55109pfu/mL。目前文库已随机测序672 个样品, 将所得双向序列进行拼接, 去除载体, 并多序列比对去除重复序列后, 发现436 条为已知功能序列, 其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp, 最大长度为2153 bp, 平均大小608.6 bp, 表明插入片段大小理想。从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A(HsCyp A)全长基因并进行序列分析。结果显示, HsCyp A 全长1229 bp, 序列包括52 bp 的5非编码区、495 bp 的开放阅读框、682 bp 的3非编码区和29 bp 的poly(A)尾, 没有明显的加尾信号。对Cyp A 氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模, 同时构建了其系统进化树, 分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。综合分析, Cyp A 在水生动物中不仅仅只是一种组成型蛋白, 而是可能在病原感染防御中发挥重要作用。
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