锌指核酸酶技术的应用

锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术是近年来发展起来的一种对基因组DNA实现靶向修饰的新技术。ZFN通过作用于基因组DNA上特异的靶位点产生DNA双链切口(double strand break,DSB),然后经过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(homologous recombination,HR)途径实现对基因组DNA的靶向敲除或者替换。该技术近些年来已经被广泛应用于基因靶向修饰的研究。本文在简要介绍ZFN技术的基础上,重点综述了目前该技术在基因靶向修饰中的应用研究进展,并同时对该技术目前所需解决的一些问题以及未来的研究方向进行了分析。     

人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术

锌指核酸酶(ZFN)由锌指蛋白(ZFP)结构域和Fok I核酸内切酶的切割结构域人工融合而成,是近年来发展起来的一种可用于基因组定点改造的分子工具。ZFN可识别并结合特定的DNA序列,并通过切割这一序列的特定位点造成DNA的双链断裂(DSB)。在此基础上,人们可以对基因组的特定位点进行各种遗传操作,包括基因打靶、基因定点插入、基因修复等,从而能够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰。这种新的基因组定点修饰方法的突出优势是适用性好,对物种没有选择性,并且可以在细胞和个体水平进行遗传操作。文章综述了ZFN技术的研究进展及应用前景,重点介绍ZFN的结构与作用机制、现有的靶点评估及锌指蛋白库的构建与筛选方法、基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,为开展这一领域的研究工作提供参考。     

序列特异性核酸酶及其在植物基因组定向修饰中的应用

通过对基因组特定区域进行精确定向遗传修饰,一方面可以针对目标序列进行精确突变,获得突变材料,对目标基因功能进行明确鉴定;另一方面可以进行目标序列的精确置换或插入,将外源基因随机导入造成的表达及遗传的不确定性降至最低。传统的基因定向修饰技术仅依赖于细胞自身的同源重组,修饰效率低下,而且还存在位置效应和遗传不稳定等诸多问题。通过引入序列特异性核酸酶（sequence—specificnucleases,SSN）,可以在基因组特定位点造成DNA双链断裂（doublestrandbreak,OSB）,促进依赖于细胞内源“同源重组”及“非同源末端连接”的DNA修复事件的定向发生,实现基因组定向遗传修饰效率的大幅提升。迄今为止,在基因组定向遗传修饰研究及应用领域,已经有多种不同类型的序列特异性核酸酶被有效使用,在多种生物中实现了不同类型的基因组定向遗传修饰。该文首先综述了SSN的结构特征及技术原理,然后对SSN技术在植物基因组定向遗传修饰中的研究进展和应用前景进行了重点介绍。     

锌指蛋白核酸酶的作用原理及其应用

锌指蛋白核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)因其能特异性识别并切割DNA序列以及可设计性,被用于基因定点突变和外源基因定点整合。目前,ZFN技术以其准确的靶位点设计能力和诱发高效率基因打靶的优势,越来越受到基因改造研究者的重视,已经成功应用于动植物细胞、胚胎的基因改造。随着鉴定靶DNA高亲和力的锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP)实验技术日渐成熟,可以预见到不久的将来这项技术会在基因工程和育种中得到广泛应用。文章介绍了锌指蛋白识别DNA靶位点和ZFN介导的基因打靶(Double strand break gene targeting,DSB-GT)的原理,同时还综述了目前ZFN技术用于基因改造的研究进展。     

锌指核酸酶技术在植物基因工程中的应用

锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)由3到4个锌指结构(zinc fingers,ZFs)和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域组成。锌指核酸酶(ZFNs)通过锌指结构(ZFs)与特异核酸位点结合,再利用FokⅠ的酶切作用切割DNA,引起特异位点DNA双链断裂(double strand break,DSB)。DNA双链断裂可以通过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ) 或同源重组(homologous recombination,HR)来修复。在修复过程中实现对基因组DNA的靶向修饰。介绍了锌指核酸酶结构、人工构建途径,作用机理和试验步骤,重点综述了锌指核酸酶技术在植物基因工程的应用。     

人工锌指核酸酶的设计与表达纯化

设计表达了四个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9 bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计两个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。     

基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景

外源DNA导入细胞并与基因组靶基因发生同源重组可以精确修饰或替换靶基因,但在植物中产生自发同源重组的概率很低.近几年出现的人工改造核酸酶可以大幅提高同源重组的效率,实现基因组的精确、定向改造.其中,归巢核酸酶、锌指核酸酶和TALE核酸酶已在植物基因工程中得到成功应用,最近开发出来的基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术则更具有高效方便等特点.这些人工核酸酶的应用为植物基因工程的发展呈现了更加美好的前景.首先介绍了基因组编辑技术及其发展历程,随后详细阐述了提高植物基因组定点编辑效率的策略,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望.     

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.     

锌指核酸内切酶:基因操作的有力工具

针对动植物进行基因靶向操作的技术,是解析基因功能、研究疾病,以及农业经济生产中一个有用的工具。至今,基因靶向操作主要是通过在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES cell)中进行同源重组或者是体细胞核转移的方法进行,但同源重组方法由于需要ES细胞而被限制在个别物种,而核转移方法存在核去分化、效率低、成本高的缺陷。近几年,一种基于锌指核酸内切酶(zinc-finger nuclease,ZFN)基因靶向修饰的新技术被应用于包括植物、果蝇、爪蟾、斑马鱼和大鼠等不同物种的基因操作。通过胚胎注射ZFN的质粒或是mRNA可以有效地定靶并迅速地在内源基因上引起可遗传的突变。ZFN介导基因靶向敲除的可行性,使得那些无法获得ES细胞和克隆技术支持的物种的基因靶向修饰成为可能。     

人造锌指蛋白的应用

C2H2锌指是真核细胞中最常见的DNA结合模体。由于C2H2锌指域靶位点特异性与结构和功能的模块性构成,使得C2H2锌指域成为构建特定的DNA结合蛋白的常用骨架。保持C2H2锌指的基本骨架不变,替换锌指特定位点的氨基酸残基,并融合表达其他功能域就可以得到具有靶向性的人造锌指蛋白(ZFP)。ZFP可以介导靶基因的转录调控,抑制或激活特定基因的表达与配体依赖的靶基因激活或抑制;对DNA进行修饰,如人造限制性内切酶,重组酶,整合酶;抗病毒感染等。因此,人造锌指蛋白应用前景广阔,研究价值显著,是未来人类基因治疗的革命性的工具。     

Genome modifications in plant cells by custom-made restriction enzymes

Genome editing, i.e. the ability to mutagenize, insert, delete and replace sequences, in living cells is a powerful and highly desirable method that could potentially revolutionize plant basic research and applied biotechnology. Indeed, various research groups from academia and industry are in a race to devise methods and develop tools that will enable not only site-specific mutagenesis but also controlled foreign DNA integration and replacement of native and transgene sequences by foreign DNA, in living plant cells. In recent years, much of the progress seen in gene targeting in plant cells has been attributed to the development of zinc finger nucleases and other novel restriction enzymes for use as molecular DNA scissors. The induction of double-strand breaks at specific genomic locations by zinc finger nucleases and other novel restriction enzymes results in a wide variety of genetic changes, which range from gene addition to the replacement, deletion and site-specific mutagenesis of endogenous and heterologous genes in living plant cells. In this review, we discuss the principles and tools for restriction enzyme-mediated gene targeting in plant cells, as well as their current and prospective use for gene targeting in model and crop plants.     

基因打靶及其应用

用活细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质,达到定点修饰改造染色体某基因的目的,此法称基因打靶．基因的同源重组是较普遍的生物现象,其分子机理尚未阐明,但活细胞内确有一酶系可使DNA的同源序列在细胞内发生重组,这一事实已无可争辨．此事实为基因打靶的理论基础．基因打靶技术操作的关键是建立一含筛选基因的重组载体,并有效地把它转入细胞核内．基因打靶命中的细胞可稳定遗传．基因打靶在改造生物品种,一些复杂生命现象（如发育的分子机制等）及临床理论研究均有广阔的前景．