人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素－11（hIL-11)546核苷酸cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL-11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒（BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hIL-11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL-11基因片段,RNA斑点杂交表明hIL-11基因得到了转录。重组病毒感BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中,SDS－PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用IL－11依赖细胞株B9－11和MTT法测定表达产物的生物活性,表明rIL-11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达。     

乙肝病毒s基因在家蚕细胞及蚕体内高效表达

把人乙型肝炎病毒(adr)的表面抗原S基因插入到家蚕核型多角体病毒基因组中,构建了重组病毒BmNPVS。用重组病毒感染家蚕细胞,测得每毫升培养物(1×10⁶细胞)HBsAg表达量达35．5μg;感染家蚕幼虫和蛹,经检测表明HBSAg产量平均为每头蚕约750μg,每只蛹约为690μg。初步纯化的表达产物经Westefn blotting和电镜观察证实,表达产物是直径为22nm的颗粒,并主要以糖基化形式存在。表达产物的浮力密度为1．2g／ml,与病人血清的HBsAg一致。     

30K蛋白对家蚕细胞及幼虫存活的作用

利用杆状病毒表达系统在家蚕BombyxmoriL.细胞BmN中表达家蚕30K蛋白,以亲本病毒BmPAK6为对照,将重组病毒Bm/r-30K分别感染BmN细胞及家蚕幼虫,观察其感染后不同时间的凋亡及存活率。与对照相比,重组病毒感染后的BmN细胞的存活率明显高于对照组,并且感染的家蚕幼虫存活时间也较长,表明体内过量表达家蚕30K蛋白有助于延长其细胞及幼虫的存活。     

家蚕浓核病毒中国株非结构蛋白1(NS1)的表达

利用PCR技术扩增出BmDNV-3 NS1基因,将目的基因与原核表达载体pET-30a进行连接,转化BL21 star菌并在该菌中表达,经Western blot鉴定表达的产物为BmDNV-3 NS1蛋白,纯化NS1蛋白并制备兔多克隆抗体.同时BmDNV-3 NS1基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBae-HTb-eGFP中,转化BmDH10BAC感受态细胞,提取的重组Bacmid通过脂质体包埋转染家蚕BmN细胞,再以收获的重组病毒感染家蚕幼虫.家蚕BmN细胞和幼虫感染重组病毒2d后均观察到绿色荧光,经SDS-PAGE分析真核表达的产物与预测的NS1-eGFP融合蛋白大小不一致,说明NS1-eGFP融合蛋白被昆虫内源性的蛋白酶降解.降解的产物用NS1蛋白抗体进行Western blot鉴定为BmDNV-3 NS1蛋白.     

AcNPV转移质粒与家蚕NPV杂交重组并在家蚕幼虫和蛹中表达及表达产物稳定性的研究

本文报道了含β－半乳糖苷酶基因的AcNPv转移质粒与家蚕NPv杂交重组并在家蚕幼虫及蛹体中进行表达的结果。在家蚕幼虫、蛹体中表达产物的量比在BmN细胞中高100倍以上,每毫升血淋巴液中表达产物可达4mg。同时还研究了表达产物在血淋巴液中的稳定性以及体液中的蛋白酶抑制剂随NPv的复制而增加的特性,获得了具有指导生产意义的结果,并扩大了AcNPv转移质粒的应用范围。     

转座子介导的多角体基因表达及提高病毒粒子的感染效率

现行的杆状病毒表达外源基因的方法是将外源基因取代病毒中的多角体基因,因而得到的重组杆状病毒感染活体时不能经口感染,只能进行针刺注射,效率低且易引起活体感染其他疾病。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mor inucleopolyhedrovirus,BmNPV)中的多角体基因(polyhedrin,poly)及其启动子片段克隆到转座子载体pigA3GFP中,将其与辅助质粒pHA3PIG利用脂质体介导法导入家蚕细胞中,经过多次筛选获得稳定的转基因家蚕细胞。之后先将BmPAK6(含LacZ)及BmGFP(含GFP)重组病毒分别感染转基因细胞,再将得到的重组病毒经口感染5龄家蚕幼虫。结果显示,重组杆状病毒可以经口感染家蚕幼虫。这些研究表明来自于转基因家蚕细胞的poly基因表达产物可以提高重组杆状病毒经口感染家蚕率,为解决杆状病毒表达系统中重组病毒不能经口感染家蚕幼虫的问题提供新思路。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

家蚕hsp20.4启动子克隆及其驱动表达产物EGT对家蚕蛹体发育的影响

为验证家蚕Bombyx mori热休克蛋白基因hsp20.4启动子的活性以及家蚕核多角体病毒egt的表达产物对家蚕发育的影响, 本实验通过PCR扩增分别得到hsp20.4启动子片段和egt片段。利用hsp20.4的启动子和红色荧光蛋白报告基因DsRed构建重组载体, 在家蚕BmN细胞以及家蚕组织中得到了瞬时表达, 表明所克隆的hsp20.4启动子序列具有热休克蛋白基因的启动子活性。又利用hsp20.4启动子和家蚕核多角体病毒的egt构建重组载体, 通过注射到蚕蛹中进行瞬时表达, 以检测egt表达产物对家蚕发育的影响, 经42℃ 1 h热诱导后, hsp20.4启动子控制的egt表达产物可以延迟家蚕发育。     

家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子(hEGF), 一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽, 具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS-hEGF, 将该重组质粒与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 筛选获得重组病毒vBacPAK-SEGF, 用vBacPAK-SEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕, Western blot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12 kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23 mg/ 106细胞, 五龄幼虫中的表达量可达到82 mg/mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb/c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性, 结果表明表达产物能显著促进Balb/c3T3细胞的增值。另外, 研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增 加, 睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。     

家蚕Bms3a基因真核表达载体的构建及其在家蚕细胞和蚕体中的表达

Bms3a基因可能在家蚕Bombyx mori抗病或细胞凋亡中有一定的作用。将融合有绿色荧光蛋白的Bins3a基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中获得了pFastBac-IE1-Bms3a-EGFP真核表达载体,利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,以重组病毒感染家蚕BmN细胞和五龄幼虫,分别在感染24h和48h检测到有绿色荧光蛋白的表达,Western blot证明表达的融合蛋白在相对分子量约57kD处出现特异条带,与预计的蛋白理论值相符。结果表明BmS3A-EGFP融合蛋白在家蚕细胞BmN及幼虫体中得到高效表达。研究结果为进一步研究BmS3A蛋白的功能奠定了基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism