用合成肽标定百日咳杆菌毒素S_1亚单位的抗原位置

<正>最近已报道了百日咳毒素基因的整个序列及氨基末端序列,一级结构的明确使合或携带自然毒素抗原决定簇的肽链成为可能。短肽的抗体与天然蛋白常常结合得很好,因为这种蛋白提供的短肽序列是暴露在分子表面的。百日咳毒素由5个不同的亚单位组成,S_1—S_5。我们和其它学者已经发现,具有酶活性的亚单位S_1是免疫显性的。本研究用接种过全细胞百日咳菌苗或只含百日咳毒素菌苗的人和动物血清,对包含S_1亚单位抗原决定簇的5种多肽序列的鉴定及合成作了阐述。     

单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文)

纯化的2型志贺毒素（Shiga toxin2,Stx2）经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子.     

重组百日咳─破伤风毒素融合蛋白诱生的抗百日咳和破伤风中和抗体及其免疫保护

重组百日咳─破伤风毒素融合蛋白诱生的抗百日咳和破伤风中和抗体及其免疫保护本文作者将含有编码百日咳毒素（ＰＴＸ）重组Ｓ１亚单位突变基因的质粒（ｐＴＸＳ１１－Ｅ１２９Ｄ）和含有编码破伤风毒素（ＴＴＸ）ｃ片段基因的质粒（ｐＳＳ１２６１）,分别经过酶的消化与...     

单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin 2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证．结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G₁/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合．在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用．该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子．     

三种抗百日咳毒素单克隆抗体的不同作用

<正>百日咳是由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病。这种微生物可产生多种具有生物学活性的产物,能引起全身性症状。有一种产物是PT,引起百日咳杆菌多种生物学作用,像已知的淋巴细胞增多促进因子、组织胺敏感因子、胰岛活性蛋白和百日咳原。PT是由具有酶活性的A原体和寡聚物B结合单位组成的A-B型结构的毒素。PT分子是五种不同亚单位组成的六聚体。SI亚单位包含A原体,其功能是由ADP腺苷二磷酸核糖鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白,它能消除结合于股上的腺苷酸环化酶的     

抗霍乱毒素B亚单位合成肽抗体的特性

<正> 有几个研究小组已报道霍乱毒素B亚单位合成肽能有效激发产生抗霍乱毒素的中和抗体。该合成肽有希望表现出霍乱毒素的生物功能,它对于研究霍乱毒素B亚单位的结构与功能(霍乱毒素结合GM_1-神精节苷脂和毒素进入细胞膜内分化)很有帮助。 我们根据霍乱毒素B亚单位结构制备出合成肽并检测了它的生物学活性。 1)根据Merrified的固相法我们合成了3个肽,CTB30-48,CTB41-50和CTB84-97(数字代表B亚单位N末端氨基酸残基的限定位置)。在合成中承蒙大阪大学Dr_1 Shimonish合作。 2)用肽-BSA(牛血清白蛋白)结合体免疫家免制备的抗肽血清与霍乱毒素呈     

百日咳毒素单克隆抗体在抗感染中的应用

百日咳毒素（ＰＴ）单克隆抗体（ＰＴ－ＭｃＡｂ）具有特异性中和体外和体内百日咳毒素的促进白细胞增多（ＬＰ）、组胺敏感（ＨＳ）、胰岛激活（ＩＡ）、腺苷三磷酸核糖基转移酶（ＡＤＰ－Ｒ）、ＣＨＯ细胞簇聚等多种生物学活性的特性,同时亦具有防御百日咳杆菌脑内和气溶胶攻击的保护作用。     

从噬菌体显示程序中筛选抗响尾蛇毒素的组合抗体的特异性和结合亲和性

我们用 Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统的组合方法制出一种对响尾蛇毒素特异的、具有高亲和力的单克隆单链抗体可变区 (sc Fv)。筛选出一个高亲和力的克隆 ,编号为 A1 0 G,对其 DNA进行了测序。A1 0 G蛋白显示出高的反应特异性 ,只与响尾蛇神经毒素、concolor毒素和 Mojave毒素有密切的关系。用第二组磷脂酶 A2 s (PLA2 s)筛选 ,与 1 1种显示出交叉反应。第一组磷脂酶 A2 s (PLA2 s)在 ELISA中有交叉反应。编码A1 0 G的基因被亚克隆到一个表达载体 ,结果表达非融合蛋白 ,标记为 A1 0 GPE,复性、纯化至表面均一性。A1 0 G与完整响尾蛇毒素和响尾蛇毒素基本亚单位的解离常数分别为 7× 1 0 - 1 0 M和 6.8× 1 0 - 9M。当 A1 0 GPE与响尾蛇毒素基本亚单位或响尾蛇全毒素以摩尔比 5 :1预先孵育 ,则没有抑制磷脂酶活性现象。然而 ,表达蛋白可以在小鼠中部分中和响尾蛇毒素同系物 -Mojave毒素的致死率     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源双价单链抗体的构建、表达及其活性的初步研究

目的:为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病,构建并高效表达中和α毒素(CPA)的特异性双价单链抗体,并对其生物学活性进行初步研究。方法:以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体sc Fv基因为模板,PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或(G4S)3,亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化;Western blot和间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性;通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果:双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正确,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小,Western blot和间接ELISA分析结果显示,构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性,且sc(Fv)2-15与抗原的结合活性明显高于sc(Fv)2-5和sc Fv,体外与体内生物活性试验结果进一步证明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力较sc(Fv)2-5和sc Fv具有明显优势。结论:成功制备了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

抗艰难梭菌毒素纳米抗体在乳酸乳球菌中重组表达及其功能分析

本研究旨在构建表达抗艰难梭菌毒素的纳米抗体重组乳酸乳球菌。所述的抗体为免疫羊驼后从外周血中分离的天然缺失轻链的纳米抗体(分别命名为E3、AA6)。构建重组质粒pNZ8148-E3-AA6,转化乳酸乳球菌NZ9000后诱导表达,SDSPAGE及Western blot检测到32 kD的目的蛋白。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白E3-AA6,BCA试剂盒测定其浓度。通过细胞变圆实验以及CCK8实验鉴定其功能,E3-AA6能够抑制艰难梭菌毒素TcdB的毒性。本实验成功构建了重组表达载体pNZ8148-E3-AA6,通过NICE系统实现了二价抗体的表达,为治疗艰难梭菌引发的感染提供了新的治疗途径。     

百日咳毒素单克隆抗体对百日咳杆菌感染后的调节

<正>百日咳毒素(PT)是一种原生型A-B结构毒素,由一酶活性A原体结合一B寡聚物组成。A原体是由单一的亚单位(S_1)组成,以腺苷二磷酸核糖基化鸟嘌呤核苷酸结合调节蛋白(G_1)而起作用,它能去除膜接合腺苷环化酶的抑制作用。B寡聚物是由S_2-S_4和S_3-S_4二聚体和一个S_5连接物组成的五聚体,它的功能是结合于细胞受体并促使A原体接近于它的被作用物。PT正如在动物模型的被动和自动免疫中所显示的,是一种保护性抗原。     

牛血清在百日咳毒素CHO细胞簇聚试验中的影响

目的观察不同胎牛血清对百日咳毒素在中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)细胞簇聚试验中的影响。方法分别用两个厂家共6批次的牛血清培养CHO细胞,连续传3代后进行细胞簇聚试验,观察添加PT阳性对照、纯化PT、脱毒PT后其细胞的簇聚效果。结果 1、2号牛血清培养的CHO细胞生长缓慢,3~6号牛血清培养的CHO细胞生长正常。质量浓度16 ng/m L的PT阳性对照和纯化PT均未引起1~2号CHO细胞簇聚;3~6号牛血清培养的CHO细胞PT阳性对照判定终点分别为2、1、16、4 ng/m L,其纯化PT判定终点分别为1、0.5、8、2 ng/m L;脱毒PT质量浓度为40μg/m L时,1、2、5号牛血清培养的CHO不簇聚,而3、4、6号牛血清培养的CHO细胞脱毒PT判定终点分别为10、5、20μg/m L。结论 6种牛血清培养的CHO细胞簇聚程度存在差异,其中以4号牛血清培养的CHO细胞对PT阳性对照、纯化PT和脱毒PT最为敏感。需筛选对簇聚试验敏感度高的牛血清用于百日咳毒素CHO细胞簇集试验。     

重组百日咳毒素Sl亚单位的纯化及免疫原性

将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOPl0两株大肠杆菌中进行表达,并对表达产物进行了初步纯化。粗制的rSl免疫家兔所得血清,用HP—PT及1B7-PT包被的ELISA测定效价,并做被动免疫保护试验。抗PT的抗体滴度为1：32000。该抗rSl血清在小鼠被动免疫保护试验中,对百日咳杆菌18323毒株进行脑腔攻击的被动免疫保护作用达到100％。证明rSl亚单位具有良好的抗原性和免疫原性,并与天然S1具有相同的抗原表位。     

重组百日咳毒素S1亚单位的纯化及免疫原性

将重组百日咳毒素S1亚单位基因的质粒在DH5α和TOP10两株大肠杆菌中进行表达,并对表达产物进行了初步纯化.粗制的rS1免疫家兔所得血清,用HP-PT及1B7-PT包被的ELISA测定效价,并做被动免疫保护试验.抗PT的抗体滴度为1:32 000.该抗rS1血清在小鼠被动免疫保护试验中,对百日咳杆菌18323毒株进行脑腔攻击的被动免疫保护作用达到100%.证明rS1亚单位具有良好的抗原性和免疫原性,并与天然S1具有相同的抗原表位.     

人源抗破伤风毒素单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及功能鉴定

实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,构建了抗体的表达载体,被命名为PET/26b/ScFv-G6。以该载体在大肠杆菌中分泌表达产物经Ni-亲和柱纯化后的小鼠试验证实,可抵抗破伤风毒素的攻击,表明为中和抗体。具有组织穿透力强,不易过敏,可直接靶向于毒素等特点,适合于破伤风的防治,具有重要的应用价值。     

利用噬菌体随机肽库筛选可结合志贺毒素B亚单位的短肽序列

以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标,利用噬菌体展示亲和淘选技术,经4轮筛选,从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆,对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定,其中A6序列出现16次,A9和A3序列分别出现2次和3次。为评价筛选克隆中和毒素毒性的能力,将展示肽出现频率最高的A6噬菌体克隆,体外与志贺毒素孵育进行动物试验,动物存活率达33.3%,表明毒素的毒性得到部分抑制,A6短肽可能发展成为志贺毒素的拮抗剂。     

A型肉毒毒素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备并鉴定抗A型肉毒毒素重链C端(BoNT/AHc)鼠源单抗。方法:以BoNT/AHc蛋白为抗原免疫小鼠,利用杂交瘤技术获得鼠源单抗,通过抗体分型、SDS-PAGE、Western印迹及ELISA法分析鉴定。结果:筛选得到3株鼠单抗1B1、1B2、1C6,重链类型均为IgG1,轻链类型均为κ型;3株纯化抗体的纯度达90%以上,均能与抗原BoNT/AHc特异性结合,亲和力常数分别为1.43×10~8、2.31×10~8、1.44×10~9L/mol;叠加ELISA结果显示3株抗体与抗原BoNT/AHc结合位点相同或相近。结论:筛选得到3株能与BoNT/AHc特异性结合的鼠源单抗,为A型肉毒毒素中和抗体的研发,以及快速有效的肉毒毒素检测方法的建立奠定了基础。     

抗H5N1病毒嵌合IgA抗体基因的构建及其在CHO细胞中的表达

为了表达具有中和活性的抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体,采用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗禽流感H5N1-HA鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因及相应的信号肽编码序列,分别与人免疫球蛋白IgA2重链恒定区、Kappa恒定区基因拼接,构建表达质粒pEF-IGHA9和pEF-IGK9,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO(CHO-dhfr-)细胞,用ELISA检测培养上清中嵌合IgA抗体的表达,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blotting印迹分析。结果成功地在CHO细胞中表达了抗禽流感H5N1病毒人-鼠嵌合IgA抗体,为制备抗H5N1重组分泌型IgA预防性抗体制剂奠定了良好的基础。     

表达抗α毒素单链抗体基因工程菌株的构建

将 2种抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体 (ScFv)基因ScFv 2E3和ScFv 1A8分别克隆至表达质粒pUC119,pET 2 0b ,pET 2 8a和pHOG2 1中 ,构建了重组质粒 ,分别转化至相应的受体菌JM10 5 ,BL2 1(DE3)和XL1 BLUE中 ,得到表达ScFv的重组菌株。ELISA和SDS PAGE分析检测表明 :经IPTG诱导后所表达的ScFv目的蛋白主要形成了包含体的形式 ,但也有少量ScFv存在于重组菌株的培养上清和胞周质中。经薄层扫描分析 :重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物分别占菌体可溶性蛋白的 4% ,重组菌株XL1 BLUE (pHOG 2E3)的蛋白表达产物占菌体总蛋白的相对含量为 2 2 % ,其相对分子量约为 31ku。表达的ScFv蛋白不但具有中和卵磷脂酶的活性 ,而且能够对致死性腹腔攻击α毒素的小鼠产生良好的被动保护作用     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体基因的克隆和表达

应用RT PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞中 ,扩增出抗体V_H 和V_L 基因 ,连接成ScFv基因 ,并将其克隆至pGEM T载体中构建了重组质粒pXScFv 2E3。经序列分析证实 ,V_H 和V_L 基因及linker基因拼接正确 ,基因全长为 726bp ,编码 242个氨基酸。随后将其定向克隆于表达载体pHOG21,转化至大肠杆菌XL1 BLUE筛选出表达菌株XL1 BLUE(pHOG 2E3)。经ELISA和SDS PAGE分析表明 ,在20℃用IPTG诱导培养时 ,表达的ScFv蛋白占菌体总蛋白的 25 %。并且ScFv基因表达产物能够中和α毒素的磷酯酶C活性