麦类作物遗传转化

麦类作物包括小麦(Triticum aestivum L.)、硬粒小麦(Triticum turgidum con v.durum Dest.e.m)、大麦(Hordeum vulgare L.)、黑麦(Secale cereal L.)、燕麦(Avena sativa L.)及小大麦(×Tritordeum Ascherson et Graebuer.).自从基因枪被发明以来,科学家们已经利用来自麦类作物的幼胚、 盾片、成熟种子胚、花粉粒、花药、幼穗、叶基组织、发芽种子幼苗的顶端分生组织及其愈伤组织或培养物作为外植体,通过基因枪、农杆菌介导、 PEG法、电激法、微注射法、硅化纤维素介导、幼穗注射法等技术先后将一些选择标记基因、报告基因和有用的目的基因如抗真菌、抗虫、 籽粒品质、抗干旱基因等转化到麦类作物中.转基因植物表现为抗性增强或籽粒的加工品质提高和营养成份增加.被转化的基因通常以单位点多拷贝的形式随机整合到受体细胞的基因组中,并以孟德尔规律遗传.整合位点一般分布在染色体的近端粒区域,整合的拷贝数大多为5～10个拷贝,最高可达到50个拷贝.在转化过程中,被转化的质粒上的片段包括选择标记基因、目标基因、甚至质粒的抗生素基因和其他无关序列,随机地连接并形成多个分子量大小不等,组成成分不同的分子簇,或首先由其中一个分子簇整合到植物基因组中,这会导致在整合位点附近产生"热点",易于其他分子簇在此处整合,从而完成两期整合;或被转化的质粒上的选择标记基因、目标基因、质粒的抗生素基因和其他无关序列、植物基因组DNA等片段共同形成各种不同类型的分子簇,当植物细胞染色体复制时,在复制叉处整合到植物基因组中.转基因可以在各种水平上表达,也会时常发生基因沉默,这会导致转基因植物DNA水平上表达但在蛋白质水平上不表达,后代偏向分离,沉默的转基因重新表达.转基因的位置效应、甲基化和启动子都会诱发转基因沉默.在麦类作物中,35S启动子易于导致转基因沉默,应尽量减少使用.转基因还导致被转化麦类作物在农艺性状和细胞学上的变异.目前,麦类作物遗传转化已经成为一种常规的技术,转基因麦类作物正开始进入商业应用阶段.相信多种转化新技术的应用和发展将会培育出高产、稳产、优质、低投入的各类品种和种质.     

无载体主干序列的bar和cecropin B 基因表达框共转化水稻

基因枪等直接转化法可将去除质粒载体主干序列的外源基因表达框导入植物基因组,消除质粒主干序列对植物基因组的影响,同时由于转基因分子较小,比较容易实现多个基因的共转化,在植物基因工程育种上有重要的应用价值,研究了基因枪介导外源基因表达框（包括启动子、基因开放阅读框和终止子）转化水稻的影响因素和转基因的整合模式,结果表明：（1）基因枪介导外源基因表达框转化水稻的频率约在0.1%～0.5%之间,非选择标准基因与选择标记基因的共转化频率约为50%～60%,增加基因表达框DNA浓度可提高转化率。相同基因构建物对不同品质水稻的转化率不同,基因构建物的侧边序列对基因枪转化的品种差异可能具有重要影响。（2）非选择标记基因cecropin B表达框在水稻基因组内整合模式简单,仅有1～3个拷贝;筛选标记基因bar表达框却比完整质粒转化后的整合模式复杂得多,插入拷贝数在4～14个之间,线形基因表达框的游离DNA末端和CaMV 35S启动中子重组热点介导的转基因重组可能是导致bar基因表达框复杂整合的重要原因。     

可育的抗除草剂溴苯腈转基因小麦

报道了采用微粒轰击（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍ ｂａｒｄｍ ｅｎｔ） 幼胚将除草剂抗性基因导入小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）的转化研究。实验共使用了１３ 个小麦品种, 从开花后１４～１８ ｄ 的籽粒中剥取幼胚, 植物表达质粒含有ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子控制的除草剂溴苯腈抗性基因ｂｘｎ 以及筛选标记基因ＮＴＰⅡ。采用高压放电基因枪,用质粒ＤＮＡ 包被的钨粒轰击预培养３ ｄ 的幼胚。在含有卡那霉素类似物ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ４１８ｓｕｌｐｈａｔｅ 的ＭＳ培养基上, 经过多步骤筛选和分化, 从８００ 多个幼胚中获得了１６ 株转化苗。除草剂抗性鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析证明, 其中４ 株为转基因植物,具有溴苯腈抗性, 并且自交可育。转化工作从分离幼胚到转化苗鉴定完毕, 最短时间为６ 个月, 因此, 该方法是一项快速有效的基因导入技术     

基因枪转化的bar基因表达盒在水稻中遗传行为复杂

基因枪介导基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)转化是基因枪转化植物的新趋势,它能消除质粒载体主干序列对转基因植物的不利影响。本文研究了基因枪转化的bar基因表达盒在转基因水稻T1～T3世代中的遗传行为。结果发现:作为筛选标记的bar基因表达盒在水稻基因组中多拷贝整合,遗传分离行为复杂,还出现了Basta抗感分离比在35:1～144:1之间的"假纯合体",但50%转基因株系中(5/10)bar基因可作为一个显性基因按孟德尔方式稳定遗传至自交T2代。虽然bar基因为多拷贝整合,30%的转基因株系(3/10)在自交低世代(T1)能获得纯合体。Southern杂交分析发现,多拷贝的bar基因表达盒倾向于连接成转基因串联子整合在水稻基因组内。我们发现在Basta抗性正常分离的株系后代中bar基因表达盒Southern杂交模式能稳定遗传,但异常分离的株系后代中bar基因表达盒的一些拷贝发生了丢失。我们推测,bar基因表达盒在水稻中遗传分离行为的复杂原因可能是bar基因表达盒多拷贝整合、基因丢失和基因表达互作。     

基因枪介导小麦成熟胚遗传转化的影响因素

小麦成熟胚作为转化受体可克服小麦幼胚存在的受季节和幼胚发育阶段限制的缺点。以湖北省小麦品种‘鄂麦12’和模式品种‘Bobwhite’为材料,成熟胚为转化受体,优化基因枪转化法的轰击压力、轰击距离、选择剂等因素,建立以小麦成熟胚为转化受体的高效转化系统。结果表明:小麦成熟胚作为转化受体时,适宜轰击压力和轰击距离组合是900 psi、6 cm;成熟胚对选择剂G418的敏感性强于幼胚,轰击后需要延长恢复时间,选择剂G418的适合浓度为20～40 mg/L。在以上优化条件下小麦成熟胚转化频率达0.3%～0.9%,已初步建立基因枪介导的小麦成熟胚遗传转化系统。     

几种玉米基因转移技术的研究及转基因植株的获得

用基因枪、超声波和子房注射法转化玉米,所用质粒pB48．415带有3’端截短的Bt毒蛋白基因和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因。用基因枪轰击玉米胚性愈伤组织和幼胚,超声波处理玉米胚性愈伤组织,用自制的微玻针注射授粉后l0～20h的玉米子房,均已成功地获得了转Bt基因的玉米檀株．点杂交和Southern吸印杂交的结果都证明在转基因玉米檀株中存在Bt毒蛋白基因。     

小麦属间杂种不同外植体的离体培养

幼胚或幼穗培养技术在克服远缘杂种生活力弱和不结实等方面得到广泛应用。已得到小麦、大麦、簇毛麦、黑麦、山羊草、冰草、偃麦草以及小黑麦等多种属间杂种幼胚或幼穗培养再生植株。近年来,我们对二倍体普通小麦、4D 缺体小麦与黑麦、小黑麦、山羊草、小偃麦杂种后代的幼胚或幼穗进行离体培养,获得大量再生植株。     

麦类作物原位杂交影响因素的研究

为了更好地利用原位杂交技术进行麦类作物外源染色体的检测和基因定位,对麦类作物原位杂交的影响因素进行了研究。（１）利用缺口转译法对克隆的ＤＮＡ 片段进行生物素标记,即节省时间,又可以获得较高的标记效率;对麦类作物的基因组ＤＮＡ,宜采用随机寡核苷酸引物标记法进行生物素标记,适当延长标记时间可以提高标记效率。（２）共变性法比较适宜麦类作物的原位杂交,分别变性法如掌握不当易使染色体产生膨胀现象,变性温度过高也会使黑麦（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌ）染色体的轮廓模糊不清。（３）应根据麦类作物亲本之间的亲缘关系决定封阻ＤＮＡ 的使用浓度,并利用生物素标记的簇毛麦（Ｈａｙｎａｌｄｉａ ｖｉｌｌｏｓａ）基因组ＤＮＡ 为探针,从普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ）－簇毛麦双二倍体的染色体中识别了簇毛麦的染色体。（４）麦类作物的原位杂交受洗脱强度的影响很大,利用甲酰胺进行洗脱可以获得背景清晰的原位杂交带型。随着原位杂交技术分辨率的不断提高,该技术还将用于单拷贝基因的染色体定位     

基因枪介导小麦遗传转化的几个重要影响因素的研究

用基因枪将携带gus-bar双标记基因的质粒pDB1及携带RC24几丁质酶基因的质粒pARN6、pBAB3、pYAO24(pYAO24还带有nptⅠ选择标记基因)以pARN6 pDB1、pBAB3 pDB1及pYAO24三种组合方式转入8个小麦品种的未成熟胚盾片组织,经选择培养获得转基因植株。对基因枪介导小麦遗传转化的主要影响因素,如基因型、材料、金粒制备和轰击参数进行分析,发现西农88是理想的转基因受体基因型,开花两周后的小麦幼胚为理想的轰击材料,制备子弹时合适的金粒含量为30～50pg／次,充分混匀金粒悬浮液可以减少幼胚损伤和提高转化频率。GUS染色发现以蔗糖为渗透剂所产生的蓝色斑点比以甘露醇为渗透剂所产生的蓝色斑点大。针对载体上的nptⅠ筛选标记基因,150mg／L的硫酸卡那霉素为较理想的选择剂浓度;针对载体上的bar筛选标记基因,PPT的浓度为2mg／L易出现假阳性植株,因此应将浓度增加到3～5mg／L。     

根癌农杆菌介导小麦幼胚遗传转化的影响因素

利用携带pC3301质粒(含bar和gus基因)的超毒根癌农杆菌菌株EHA105对普通小麦(Triticum aestivum L.)扬麦158进行了遗传转化,对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、幼胚预培养时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、洗涤用液及筛选方式等影响转化的几个重要因素进行了讨论.对从294个小麦幼胚外植体中转化得到的5株成活植株进行了PCR和Southern blot分析,结果表明其中2株小麦基因组中整合了外源DNA,转化频率为0.68%.     

麦类作物小孢子培养与遗传转化研究进展

小孢子作为单个单倍体细胞,通过诱导培养能再生成纯合的二倍体植株,不仅为分子生物学、遗传学、形态发生学研究提供稳定的材料,也对小麦等作物的转基因研究提供新方向和新思路。本文主要介绍麦类作物小孢子培养的基本步骤及关键因素,简要介绍了以小孢子为材料进行小麦基因遗传转化的方法。     

主要农作物转基因研究现状和展望

近15年来,大豆、水稻、玉米、小麦等主要农作物转基因研究取得了较大进展,几乎各种遗传转化方法在这些作物上都取得了成功,尤其是农杆菌介导法,不仅在难转化的双子叶作物大豆上取得了成功,而且在单子叶作物水稻、玉米、小麦上先后取得了突破。同时,将一些与重要性状改良有关的外源基因转入了主要农作物,包括抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、品质改良、发育调控、营养吸收等。转基因大豆、玉米、棉花、油菜在生产上得到了大面积种植,产生了极大的经济效益,2004年全球转基因作物的种植面积达到了8100万公顷。本文对大豆、玉米、水稻和小麦等主要农作物转基因研究历史和产业化现状进行了综述,并对主要农作物转基因研究中存在的问题进行了分析。     

小麦族遗传资源的多样性及其保护

禾木科小麦族中包含了三种世界最重要的粮食作物,即：小麦、大麦和黑麦以及许多具有重要经济价值的牧草种类。小麦族植物种类繁多、分布广泛、生态多样,具有极其丰富的形态和遗传变异类型。作为巨大的基因资源库,小麦族植物在通过现代生物技术而导入外源有益基因的麦类作物育种程序中,具有重要和特殊的价值。然而对于小麦族植物的生物多样性的研究和了解还远远不足。同时在全球环境的不断改变和遭到破坏的今天,一些小麦族的物种已处于濒危的状态而面临灭绝,因此对于小麦族丰富的遗传多样性制定有效的措施进行保护是摆在我们面前亟待解决的课题。     

高粱遗传转化研究进展

高粱是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大豆的重要作物之一,然而由于其高效、稳定的遗传转化体系的建立较难,限制了其转基因研究进程.近年来,随着转基因技术的不断发展和完善,高粱转基因研究也取得了飞速的发展.从高粱遗传转化再生系统中外植体的选择、转化方法、影响转化和基因表达效率的因素等几方面进行了综述,并总结转基因高粱研究进展.     

小麦遗传转化研究进展

小麦作为最重要的3大禾谷作物之一,其离体培养具有很强的惰性,再生频率与水稻、玉米相比要低一些,目前大多通过对基因型和外植体的选择来达到植株的高频再生分化,因此其遗传转化就远远滞后于水稻和玉米,更不用说与其它双子叶植物相比了.重点综述了小麦转基因技术和外源基因在小麦中的遗传转化研究现状,其内容包括几种主要的小麦转基因方法和以基因枪法为主的各种转化技术对品质基因、抗除草剂基因和抗病等基因在小麦中的遗传转化研究进展,并对存在的一些问题进行了简要的论述.     

Resistance to biotic and abiotic stress in the Triticeae

Poverty, hunger and malnutrition occur in many parts of the world despite the enormous progress that has taken place in agriculture and food production in the last century. It is estimated for wheat, that by 2020 the world will require a 60% increase in production to meet the projected requirement. Resistance to both biotic and abiotic stresses will be critical in reaching this goal. Distinct advantages accompany the use of genetic resistance to biotic and abiotic stresses. The most important advantage is the fact that response to the stress situation occurs independently of the managerial ability, skill and resource level of the producer. Anyone can use a stress resistant crop. Immense progress has been made in the field of functional genomics and molecular manipulation. It is clear that the restraining factor in future will not be the availability of scientific techniques and tools, or for that matter, genetic resources; but the human and financial capacity to achieve the goals on a world-wide scale so that they really do make a difference to the livelihood of the poor. Triticeae form a meaningful proportion of staple and non-staple food crops around the world. To achieve world-wide food security in the future, Triticeae with resistance to stresses will have to play a major role. The future demands crops with stable yield irrespective of environmental constraints, good quality and a high nutritional value; crops that are free of pesticide residues and other harmful substances.     

短柄草与麦类作物的比较基因组学研究进展

麦类作物是人类主要的食物来源,其遗传改良对于保障世界粮食生产具有重要作用。获得麦类作物的基因组和功能基因组信息是作物遗传育种学家解析种质资源高产及抗逆机理,并准确选择目标性状、实现分子设计育种目标的有效途径。目前,二穗短柄草（Brachypodium distachyum）是早熟禾亚科中唯一完成全基因组测序的植物。以二穗短柄草为模式植物,利用比较基因组学方法获得早熟禾亚科中基因组庞大而复杂的麦类作物的相关信息,必将加速麦类作物的遗传改良进程。本文重点介绍近十年来短柄草在麦类作物比较基因组学方面的研究进展。     

Age-dependent transformation frequency in elite wheat varieties.

Wheat is a major world crop and as such is a primary target for improvement of agronomic characteristics via genetic engineering. Optimization of transformation is essential in order to overcome the relatively low transformation frequencies encountered with wheat. Transformation of elite wheat varieties is not always successful due to variability in regeneration and transformation frequencies between varieties. In this work, two elite wheat varieties with a relatively high embryogenic capacity were transformed by particle bombardment. A strong correlation between transformation frequency and the age of wheat donor plants was observed in both varieties. The mean transformation frequency rose from 0.7% to 5% when using immature embryos from old and young donor plants, respectively. This was observed in both varieties, the best bombardments achieving up to 7.3% frequency. Using explants at an optimal developmental stage from donor plants grown under environmentally-controlled conditions has improved the reproducibility of transformation efficiency of elite wheat varieties and leads to the production of apparently phenotypically normal, fertile, transgenic plants.     

质粒DNA物理形态和其它因素对获得可育转基因小麦的影响

本工作分析了不同形态质粒DNA和未成熟胚高渗透压处理对基因枪小麦转化体系的适用性.高渗处理对瞬间表达和转基因小麦的再生均有明显的促进作用.轰击之前对质粒DNA进行变性处理导致瞬间表达反应大幅度下降,但稳定转化频率(指从100个轰击未成熟胚得到的再生可育转基因植株数)与双链DNA相差不大.使用单链质粒DNA、线性双链质粒DNA和环状双链质粒DNA均可以得到转基因小麦植株.迄今已得到26个不同的转基因冬小麦株系和4个不同的转基因春小麦株系.这些转基因小麦大多数已产生种子,几个春小麦株系已获第二代种子.