用体内激活的启动子调控HCV核心抗原表达可增强重组鼠伤寒沙门氏菌的免疫原性

为提高抗原表达质粒在重组伤寒沙门氏菌中的稳定性以增强重组伤寒沙门氏菌诱导的免疫应答 ,克隆鼠伤寒沙门氏菌pagC基因启动子 ,以其为转录调控元件构建HCV核心抗原表达质粒 ,转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中。体外培养时 ,Mg2 能够剂量依赖性抑制该重组菌表达HCV核心抗原。将该重组菌和组成性表达的重组菌分别口服接种BALB/c小鼠 ,观察质粒的稳定性和小鼠的免疫应答。结果表明 ,体内激活的pagC基因启动子能明显提高质粒在重组鼠伤寒沙门氏菌中的稳定性和增强重组菌诱导的体液和细胞免疫应答 ,这为发展高效免疫、成本低廉的口服丙肝疫苗提供了一个新思路     

以减毒沙门氏菌为SARS-CoV N DNA口服疫苗载体的初步研究

目的:以减毒沙门氏菌为载体运送SARS-CoV N DNA疫苗至小鼠体内,研究其诱导的免疫应答情况,评价减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗的免疫效果。方法：将含SARS-CoV N基因的pcDNA-N质粒导入减毒鼠伤寒沙门氏菌CS022中,采用口服和滴鼻相结合的方法免疫BALB/c小鼠,以ELISA检测不同时间免疫小鼠血清中抗体及其亚型;以MTT法测定特异性淋巴细胞增殖反应;ELISPOT检测细胞因子;流式检测T细胞亚型。结果：pcDNA-N DNA疫苗口服免疫后2周就可以诱生特异性IgG抗体,且以IgG2a占优势;诱导了较高水平的淋巴细胞特异性增殖反应和IFN-γ,主要以Th1免疫为主。结论：减毒沙门氏菌可以有效运送pcDNA-N重组质粒并诱导产生特异体液和细胞免疫应答,为减毒细菌作为DNA疫苗运送载体的研究提供了参考依据,也为SARS疫苗研究开辟了新方法。     

以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体。方法：以pMD-18T-P32/LD为模板,通过聚合酶链反应（PCR）扩增出山羊痘病毒P32基因片段,定向插入真核表达载体pVAX1中,再重组表达质粒pVAX1-P32/LD。转入DH5α,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌,通过双酶切、PCR及插入片段序列测序对质粒进行鉴定。结果：携带山羊痘病毒P32基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗S7207/pVAX1-P32/LD已成功构建。结论：为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG。然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)。将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109CFU,5×109CFU,1×1010CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性。在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重。以5×109CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P<0.01)。攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景。     

山羊痘口服疫苗构建及其安全性、稳定性检测

目的:探索山羊痘新型疫苗.方法:将山羊痘病毒P32基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207(aroA-);重组菌以不同浓度灌暇小鼠进行安全性检测,同时进行稳定性检测.结果:重组减毒沙门氏菌质粒PCR鉴定与预期大小(986bp、1 134bp)一致,完成山羊痘口服疫苗构建;安全性试验结果表明除1010CFU剂量组小鼠呈现轻微反应外,其它组别小鼠均健康存活;体外连续培养10代菌能检测到目的基因,以109CFU剂量灌服小鼠,在第1d、第3d肠内容物和第5d脾脏中分离到重组菌.结论:成功构建了以减毒沙门氏菌为载体的山羊痘口服疫苗,且具有良好的安全性和稳定性,为山羊痘新型疫苗的进一步深入研究奠定了基础.     

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因

用长距离RT-PCR扩增了传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）ZJ2000株多聚蛋白基因,定向克隆入真核表达载体Pci,电转化dam^-和phoP^－双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株,并直接转染Vero细胞。RT-PCR和间接免疫荧光试验可从Vero细胞中检测到阳性信号,SDS-PAGE和West blotting均可检测到41kD的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌可将外源基因导入Vero细胞,并进行转录和表达,具有免疫反应性,为进一步研制减毒沙门氏菌为载体的IBDV口服DNA疫苗打下基础。     

以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性

目的：构建以减毒沙门氏菌为载体的小鼠肝炎病毒DNA疫苗,研究该疫苗的免疫原性。方法：以小鼠肝炎病毒S1基因的重组真核表达质粒pVAX1—S1免疫BALB／c小鼠,ELISA检测其诱导抗体产生情况;再将重组质粒pVAX1—S1电转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建运送S1基因的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX1—S1）,口服免疫BALB／c小鼠,间接免疫荧光试验鉴定减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗的免疫原性。结果：与pVAX1空载体对照组相比,重组真核表达质粒pVAX1—S1免疫组二免及三免后抗体水平分别存在显著性差异（P〈0．05）和极显著性差异（P〈0．01）。减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗SL7207（pVAX1—S1）诱导小鼠产生了特异性的血清抗体。结论：构建的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX1—S1）具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答。这为进一步研制冠状病毒新型基因疫苗奠定了基础。     

恶性疟原虫74肽抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌的表达和家兔免疫应答

利用减毒鼠伤寒沙门氏菌来表达外源抗原并制备口服活菌苗,是疫苗研究的一个新的突破。作者已在减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261以β—半乳糖苷酶(GZ)融合蛋白的形式表达了人工合成的恶性疟原虫74肽基因HGFC。现报道用活菌SL3261(pWRC)(C组)、SL3261(pWR450-1)(R组)分别免疫新西兰家兔,研究其在家兔体内免疫应答的结果。     

霍乱毒素B亚单位基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达

本工作成功地将霍乱毒素B亚单位(ctx B)基因插入到带有天门冬氨酸β-半醛脱氢酶基困(asd+)的pYAZ48质粒中,并将它转化至天门冬氨酸β-半醛脱氢酶突变(asd-)鼠伤寒沙门氏菌中。实验结果表明,ctx B亚单位基因能在鼠伤寒沙门氏菌中高效表达,并且表达的蛋白能分泌到细胞外。动物实验结果也表明：该疫苗菌株能在肠粘膜细胞定居;口服及全身免疫均能产生较高的抗体,并能增强动物细胞的免疫功能;对伤寒、霍乱有毒株的攻击有良好的保护效果。该系统的应用为疫苗基因工程提供了一个新的途径。     

鼠伤寒沙门氏菌SL7207 SifA-突变株的构建和鉴定

鼠伤寒沙门氏菌SifA^-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA^-突变株SL7207,该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力,SL7207。在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强,但在RAW264．7巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207。在BALB／c小鼠体内毒力下降。仅SL7207在体外可向RAW264．7巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。     

以沙门氏菌作为载体菌苗表达系统的研究进展

疫苗在疾病预防中的地位日益重要,口服疫苗,尤其是利用基因工程构建的多价口服活菌苗,制备简单,使用方便,可提供针对多种病原体的免疫保护作用,是疫苗发展的一个重要方向。以减毒的沙门氏菌作为异源抗原基因的载体用作口服活菌苗的研究是近几年来的一个热点,利用质粒来表达外源抗原基因并将其导入减毒的沙门氏菌活菌苗中存在不少缺点,许多研究者相继构建了不同的染色体整合系统,将外源抗原基     

以减毒沙门氏菌运送的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的构建及其对小鼠的免疫原性

根据GenBank中已发表的H5亚型禽流感病毒HA基因序列,设计一对引物,通过RTPCR扩增鹅源H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1和asdpVAX1得到重组表达载体pVAX1HA和asdpVAX1HA。将重组质粒转染P815细胞,经间接免疫荧光试验证实,HA基因在细胞内得到了瞬时表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550得到两种运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550（pVAX1HA）和X4550（asdpVAX1HA）,以1×109CFU/只的剂量两次口服免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠不仅可以检测到HA特异性的血清抗体应答,而且还能抵抗稳定表达H5亚型禽流感病毒HA基因的P815肥大细胞瘤的攻击,说明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

鼠伤寒沙门氏菌SL7207SifA-突变株的构建和鉴定

鼠伤寒沙门氏菌SifA-基因突变株的特点是能进入真核细胞的胞液。利用P22噬菌体转导技术构建了鼠伤寒沙门氏菌疫苗株SL7207的SifA-突变株SL7207*,该突变株与SL7207有着相似的体外生长曲线和细胞侵袭力,SL7207*在MDCK上皮细胞中的增殖能力增强,但在RAW2647巨噬细胞中的生存能力减弱。小鼠毒力试验显示SL7207*在BALB/c小鼠体内毒力下降。仅SL7207*在体外可向RAW2647巨噬细胞递送真核表达质粒。SL7207*的构建为重组沙门氏菌疫苗载体的研制提供了一个新的选择。     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

染色体整合系统在多价疫苗构建中的应用研究

通过同源重组将编码异源抗原的DNA整合到减毒的鼠伤寒沙门氏菌的染色体上,获得了表达霍乱毒素B亚单位（CTB）的双价活疫苗候选株。该系统包括两个步骤：首先将GisOG缺失突变的DNA片段整合进鼠伤寒沙门氏菌疫苗候选株SL3261的染色体上,得到His营养缺陷型。然后,用带有CTB抗原基因的完整HisOGDNA片段置换HisOG缺失的DNA片段,获得表达CTB的His回复的SL3261菌株（命名为TT201）。Southern杂交证明,TT201菌株的染色体带有CTB抗原基因。Westernblot分析表明,TT201菌株能表达CTB,且具有很好的稳定性。用重组菌株口服免疫接种小鼠,能够激发抗CTB抗体的产生。TT201菌株是一种潜在的双价疫苗候选株。     

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达新城疫病毒融合蛋白

RT PCR扩增了新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株的融合蛋白 (F)基因并插入到 pcDNA3的CMV启动子下游 ,构建成真核表达质粒pcDNA3 F ,高压电转化dam和 phoP基因双突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌 (ZJ111株 ) ,并直接感染Vero细胞 ,分别提取细胞总DNA和总RNA ,DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验 ,可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测F蛋白结果表明 ,转染后 4 8h开始表达 ,随后逐渐增多。SDS PAGE和Western印迹可检测到 5 5kD的蛋白质条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞 ,而且还得到了转录和表达 ,表达的F蛋白具有免疫反应性 ,为研制减毒沙门氏菌为载体的口服NDVDNA疫苗创造了条件。     

重组质粒在减毒沙门氏菌中的稳定性及其对细菌侵袭力的影响

将含有外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3-F和pCI-F转化减毒鼠伤寒门氏菌,探讨质粒类型和插入片段对重组质粒在细菌内的稳定性和细菌侵袭力的影响。结果表明,外源质粒可降低减毒沙门氏菌在体外的增殖能力和侵袭力,也影响细菌在鸡体内的存活力;就质粒类型而言,pCI的影响大于pcDNA3,而以携带外源基因的重组质粒影响较为显著;外源基因插入也影响质粒在宿主菌内的稳定性。提示利用减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗研究时,要考虑质粒类型与其在宿主菌内稳定性的关系、携带外源基因重组质粒对载体菌侵袭力和存活力的影响等问题。     

鼠伤寒沙门菌pagC启动子的克隆与活性分析

从鼠伤寒沙门菌中克隆出pagC启动子(PpagC),构建体内激活的表达质粒pZW,插入庚型肝炎病毒（HGV）NS3基因,构建出表达质粒pZWNS3。以其转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,观察PpagC的启动活性。结果表明：Mg2+可抑制PpagC的启动活性,Mg2+浓度小于50mmol/L时培养的重组菌经SDSPAGE和Western blot检测能高水平表达HGV NS3蛋白。Mg2+浓度升至50mmol/L时,NS3蛋白表达量明显降低。收集以50mmol/L Mg2+的培养基扩增的重组菌,灌胃接种C57小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果显示PpagC是一个强的宿主体内激活的启动子,为构建以伤寒沙门氏菌为载体的高效免疫口服疫苗提供了一个新的途径。     

家犬用狂犬病口服基因工程疫苗的研究初探

中国的狂犬病主要由农村家犬通过咬伤传染所致,为了研制高效实用的家犬用狂犬病口服基因工程疫苗,本研究把狂犬病病毒G蛋白基因插入真核表达质粒pIRESneo,构建重组表达质粒pIRESneo-G,转化入鼠伤寒减毒沙门氏菌SL3261,构建重组口服疫苗SL3261-pIRESneo-G。通过口服免疫小鼠,检测免疫血清中和抗体水平及其病毒保护效果。结果显示,经小鼠口服免疫接种一次后第三周能产生高水平的中和抗体水平,达到WHO要求的0.5 IU/mL;免疫小鼠经肌肉注射100 LD50/0.03 m L的野毒株GX074后获56%保护效果。     

携带鼠源基因的沙门氏菌对肿瘤的预防作用

探讨减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服基因治疗载体的可行性.通过电转化法将真核表达载体pCMVmIL-12、pCMVmGM-CSF、EGFPN1导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中,经由胃管饲于BALB/c和C57BL/6小鼠.6周后分别用4T₁乳腺癌细胞和Lewis肺癌细胞进行攻击.通过流式细胞仪、共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在小鼠各组织中的表达,通过PCR和ELISA的方法检测mIL-12、mGM-CSF基因的整合和表达情况.并考察肿瘤的受抑情况和小鼠的生存期.结果表明：在小鼠的肝、脾、小肠、肾脏和肿瘤中可检测到绿色荧光蛋白的表达和相应细胞因子基因的整合.血清中相应的细胞因子水平较对照组明显升高（P＜0.05）,生存期远远超过对照组小鼠（P＜0.05）.减毒沙门氏菌可作为口服基因治疗载体,为肿瘤的预防和治疗提供一条简便、安全、有效的途径.