受番茄花叶病毒侵染后寄主的超微病变研究

电镜观察了番茄花叶病毒（ＴｏＭＶ）侵染不同寄主的细胞超微结构变化。在２５℃下ＴｏＭＶ侵染番茄（ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌｌ）后,病毒粒子在叶片的表皮,薄壁细胞,维管束组织的细胞质中形成大块结晶体和类结晶体,液泡膜处产生小泡结构,有多泡体和髓鞘样结构构伸入液泡中,在２５℃下ＴｏＭＶ侵染珊西烟（ｉｃｏｔｉａｎａｔａｌａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉｎｎ）后,除存在病毒结晶体和类结     

辣椒疫霉致病毒素

辣椒疫霉在培养液中振荡培养时可分泌毒素,这种纱能经志辣椒叶片形成水渍状褐腐斑,类似病原菌侵染后形成的症状,Ｐｌｉｃｈ’ｓ和Ｖ８Ｃ２液适于Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ的生长和产毒;生长适宜温度和ＰＨ范围分别为２０－３０℃和ＰＨ６－７,在２５－３０℃、Ｐ５－８的条件下２滤液毒性最强;培养１５天产毒达到最高值,液先后经８５％硫酸铵沉淀,ＤＥ５２、Ｃ几ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层将毒素纯化。经鉴定该纯毒素为３９．８     

肾综合征出血热病毒基因检测及分型的研究

根据流行于我国的两型ＨＦＲＳＶ代表株汉滩型７６１１８株及汉城型Ｒ２２株Ｍ节段的核酸序列,设计两型共同引物,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法,检测３９株从不同地区、不同宿主分离的ＨＦＲＳＶ感染鼠脑及细胞培养物;同时还建立了捕捉ＥＬＩＳＡ法（ｃＥＬＩＳＡ）,检测了３９株中的３６株,每份样本设复孔,以Ｐ／Ｎ≥２．１０且Ｐ－Ｎ≥０．１０者判为阳性。ＲＴＰＣＲ及ｃＥＬＩＳＡ两法的检出率分别为９７．６％与８２．４％,二者符合率８４．６％。此外,对ＲＴＰＣＲ产物进行酶切分型,３８份扩增产物中的１５份可被ＡｌｕＩ切开。根据所获酶切图谱的差异,可分为汉滩型及汉城型两型,显示了酶切分型的潜在价值     

昆虫杆状病毒衣壳主蛋白基因的PCR扩增,克隆和定位

用ＰＣＲ技术成功地扩增了苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）的衣壳主蛋白基因（ｖｐ３９基因）,并克隆了该基因,利用纯的ｖｐ３９基因探针,在低严谨杂交条件下,已将粘虫核型多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ｖｐ３９基固定位在ＰｓｔＩ－Ｆ,ＢａｍＨＩ－Ｃ,ＥｃｏＲＩ－Ｃ,ＸｈｏＩ－Ｄ,Ｉ,ＥｃｏＲＶ－Ｈ,Ｘ等片段上。ＰＣＲ反应时,在扩增出预期的包括完整ｖｐ３９基因的１４０６ｂｐ片段的同时也扩增出一条Ｃａ．４００ｂｐ的片段,本文讨论了ＰＣＲ的特异性扩增和非特异性扩增。     

利用TMV—U1作为载体表达鼠肝炎病毒S糖蛋白片段

为了验证转基因烟草中表达的外壳蛋白（ＣＰ）能够重新包被侵入的烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的假设,利用抗原表位标记的方法观察ＣＰ亚单位在病毒５′端的交换。通过ＰＣＲ 方法将来源于鼠肝炎病毒（ＭＨＶ） Ｓ蛋白的两个小肽段（１１ ａ．ａ．和１５ ａ．ａ．）的ＤＮＡ序列分别插入ＴＭＶ－Ｕ１ ＣＰ基因邻近３′端的两个位点,并构建了带有外源序列的ＴＭＶ 侵染克隆Ｖ９ （１１ ａ．ａ．）和Ｅ１５ （１５ ａ．ａ．）。通过体外转录反应,得到Ｖ９ ＲＮＡ 及Ｅ１５ ＲＮＡ。突变病毒ＲＮＡ 侵染烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ）后表现不同特性。Ｖ９ 和Ｅ１５ 侵染ＸａｎｔｈｉＮＮ烟草后同野生型ＴＭＶ一样产生枯斑。但是,当它们侵染Ｘａｎｔｈｉｎｎ 烟草时,Ｖ９ 产生同侵染ＸａｎｔｈｉＮＮ 烟草相同的枯斑,而Ｅ１５的特性同ＴＭＶ－Ｕ１几乎完全相同,能对Ｘａｎｔｈｉｎｎ 烟草进行系统侵染并在叶片中聚集大量的带有外源片段的外壳蛋白,而且病毒的结构极其稳定。Ｖ９ 和Ｅ１５ 特性的差异可能是由于外源片段在外壳蛋白中存在位置的不同影响了外壳蛋白的结构所致     

根瘤菌胞外多糖的结构与信号功能

共生固氮菌如根瘤菌属(Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ)、中华根瘤菌属(Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ)等,能在豆科作物的根部形成独特的根瘤结构,并在根瘤内将氮气固定为氨供宿主利用。根瘤菌与宿主植物的共生体系的形成是有种属特异性的,也就是说一种根瘤菌只能侵染为数不多的几种植物。根瘤形成因子(ｎｏｄｆａｃｔｏｒ,ＮＦ)对这种特异性起了重要的决定作用。ＮＦ是在植物类黄酮的诱导下由根瘤菌合成的一种脂酰基甲壳寡糖,不同根瘤菌的ＮＦ在结构上是不同的。除ＮＦ之外,根瘤菌胞外多糖(ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ,ＥＰＳ)是对宿主植物特…     

家蚕核型多角体病毒中国株和日本株vp39基因的比较研究

以苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的核衣壳蛋白基因ｖｐ３９设计引物,用ＰＣＲ技术扩增了家蚕核型多角体病毒中国株（ＢｍＮＰＶ－Ｃｈ）－１．３ｋｂ片段并测定了其全序列长１２３０ｂｐ。推导的氨基酸３５１个,其与ＢｍＮＰＶ日本株（ＢｍＮＰＶ－Ｊａ）ｖｐ３９基因核苷酸序列同源性达９７．５％,氨基酸同源性达９７．１％。该片段在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１中诱导表达能产生分子量约为３８ｋＤ的特征性蛋白带,证明所扩增片段为Ｂｍ     

一种强启动子的分离与功能

以棉花曲叶病毒（ＣＬＣｕＶ）侵染的番茄叶片组织总ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ反应扩增ＣＬＣｕＶ双向启动子片段并插入克隆载体。序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长４３６ｂｐ,与目前发现的４类ＣＬＣｕＶ分离物的启动子序列的同源性最高为９９．３２％。将启动子片段分别以不同方向与ｇｕｓ报告基因和ｎｏｓ终止子融合,构建了瞬时表达载体。通过基因枪法将质粒载体导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）     

水稻叶片中过氧化氢与核酮糖—1,5—二磷酸羧化酶／加氧酶降解 …

甲基紫精（ＭＶ）处理水稻植株能快速诱导核酮糖－１,５－二磷酸羧化酶／加氧酶（Ｒｒｂｉｓｃｏ,ＥＣ４．１．１．３９）及其它可溶性蛋白的降解。ＭＶ浓度越高,降解速率越高。ＭＶ能诱发叶片内源Ｈ２Ｏ２迅速积累。光合电子传递抑制剂ＤＣＭＵ（１５０μｍｏｌ／Ｌ）能显著抑制ＭＶ（１００μｍｏｌ／Ｌ）诱导的Ｒｕｂｉｓｃｏ及其它可溶性蛋白的降解;活性氧清除剂抗坏血酸（５ｍｍｏｌ／Ｌ）、甘露醇（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、苯     

汉滩病毒S基因及其5‘端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义,为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物,用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ）,用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中,成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体,并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率,目　的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。     

Construction of Stably Transformed Bm5 and Sf9 Cells Displaying Green Fluorescence by Using Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus IE1 Gene

Transformed Bm5 or Sf9 cells displaying green fluorescence were constructed by using Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) immediate early gene (ie 1). Green fluorescent protein (gfp) gene was introduced under the control of the AcNPV ie 1 promoter to yield expression plasmid pAcIE1-GFP. It was transfected into Sf9 or Bm5 cells and cell clones expressing GFP were selected by fluorescence microscopy. Genomic DNA from transformed cells was isolated and integration of AcNPV ie 1 gene harboring gfp gene was confirmed by PCR using AcNPV ie 1 gene-specific primers. The GFP was successfully expressed in the cytoplasm of insect cells transformed with pAcIEI-GFP and the expressed GFP was maintained during cell division. Furthermore, GFP expression by AcNPV ie 1 promoter in transformed cells was not interfered with viral replication. This suggests that transformed cells displaying foreign gene product by using AcNPV ie 1 promoter will be useful for the diverse applications of the insect cells.     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。     

重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR（overlap extension PCR）法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（ltb）的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC（44815）质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221（DE3）进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21（DE3）中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。     

肠产毒性大肠埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亚单位的原核表达及免疫学鉴定

目的克隆并表达肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG,为制备预防幼畜ETEC感染的疫苗奠定基础。方法以ETEC（C83902）基因组DNA为模板,PCR扩增faeG基因,插入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-faeG。将pGEX-faeG转化大肠埃希菌BL-21I,PTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Western blot鉴定其抗原性。将表达菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗FaeG的IgGI、gA,鉴定其免疫原性。结果扩增的faeG基因全长786 bp,与基因文库中的faeG基因同源性达96%。重组质粒pGEX-faeG经PCR及双酶切鉴定确有插入片段,且序列完整。表达产物FaeG相对分子质量约53 kD,主要存在于碎菌后的沉淀中,以包涵体形式表达。Western blot显示该蛋白可与ETEC F4ac阳性血清特异性结合,免疫后小鼠血清抗FaeG IgGI、gA明显高于PBS和GST对照组。结论成功构建了ETEC F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG的重组质粒pGEX-faeC,表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制预防幼畜ETEC感染的疫苗。     

Neurturin基因克隆及在大肠杆菌中表达

Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ Ｎ Ｔ Ｎ）是最近发现的一种与胶质细胞源性神经营养因子（ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ）相关的神经营养因子．利用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法以染色体 Ｄ Ｎ Ａ 为模板,扩增获得了编码人 Ｎ Ｔ Ｎ 成熟蛋白的基因,将其克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９ 质粒,进行序列分析,结果与文献报道一致．将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体ｐ Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ 系统,在宿主菌 Ｔｏｐ１０ 中获得了高效、稳定表达,表达的ｈ Ｎ Ｔ Ｎ 占菌体总蛋白 ２０％ 左右．这为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础．     

白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达

目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。     

Expression of the influenza virus haemagglutinin in insect cells by a baculovirus vector.

The insect baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) has played a major role in studies on the molecular biology of insect DNA viruses. Recently, this system has been effectively adapted as a highly efficient vector in insect cells for the expression of several mammalian genes. A cDNA sequence of the influenza (fowl plague) virus haemagglutinin gene has been inserted into the BamHI site of the pAc373 polyhedrin vector. Spodoptera frugiperda cells were co-transfected with this construct, pAc-HA651, and authentic AcNPV DNA. Recombinant virus was selected by adsorption of transfected cells to erythrocytes followed by serial plaque passages on S. frugiperda cells. We have determined the site of insertion of the haemagglutinin gene into the AcNPV genome by restriction enzyme cleavage and Southern blot hybridization analyses using haemagglutinin cDNA as a probe. The influenza haemagglutinin gene is located in the polyhedrin gene of AcNPV DNA. Immunofluorescent labelling, immunoprecipitation and immunoblot analyses with specific antisera revealed that S. frugiperda cells produce immune reactive haemagglutinin after infection with the recombinant virus. The haemagglutinin is expressed at the cell surface and has haemolytic capacity that has been activated by post-translational proteolytic cleavage. When chickens were immunized with S. frugiperda cells expressing haemagglutinin, they developed haemagglutinin-inhibiting and neutralizing antibodies and were protected from infection with fowl plague virus. These observations demonstrate that the haemagglutinin is processed in insect cells in a similar fashion as in fowl plaque virus-infected vertebrate cells and that it has full biological activity.     

Strong and regulated expression of Escherichia coli beta-galactosidase in insect cells with a baculovirus vector.

The N-terminal region of the gene encoding polyhedrin, the major occlusion protein of the insect baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), has been fused to DNA encoding Escherichia coli beta-galactosidase. The fused gene was inserted into the AcNPV DNA genome by cotransfection of insect cells with recombinant plasmid DNA and wild-type AcNPV genomic DNA. Recombinant viruses were selected as blue plaques in the presence of a beta-galactosidase indicator, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside. Studies of one such virus, L1GP-gal3, indicated that the synthesis of beta-galactosidase is temporally controlled beginning late (20 h) in infection after the release of infectious virus particles from the cell. By 48 h postinfection, a remarkably high level of expression is achieved. On the basis of these results, AcNPV should be a useful vector for the stable propagation and expression of passenger genes in a lepidopteran cell background. A generalized transplacement vector that facilitates the construction and selection of recombinant viruses carrying passenger genes under their own promoter control has also been developed.     

片球菌素pediocin PA-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建编码细菌素pediocin PA-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papA,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papA片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin PA-1。结论papA基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73基因主要抗原表位区的融合原核表达

人工合成VP73基因全长序列,利用DNAstar软件确定其中抗原性较高的区域,利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物,通过PCR扩增得到243bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段（vp73l）。将该片段与表达载体pET-32a连接克隆至大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)DH5α菌株,经测序、菌落PCR和酶切鉴定,选取VP73L基因正向插入,读码框正确的阳性克隆。构建重组质粒并转化BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合蛋白以可溶性形式在E.coli BL2（DE3）高效表达,经His亲和层析柱得以纯化。Western blotting显示,该融合蛋白能与兔抗非洲猪瘟病毒VP73多克隆抗体发生特异性反应。所得结果为进一步研究:分离纯化该重组融合蛋白;确证目标抗原蛋白VP73L免疫原性及其特异性,进而达到建立非洲猪瘟病毒的免疫检测方法奠定了必要的材料与技术基础。