草菇蛋白酶的分离、纯化及等电点的测定

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属典型高温真菌。低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解,导致草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。在分离、纯化草菇蛋白酶的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了蛋白酶的等电点,为草菇低温自溶与蛋白酶之间的关系的研究奠定了基础。     

草菇蛋白酶的分离、纯化及等电点的测定*

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属典型高温真菌。低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解,导致草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。在分离、纯化草菇蛋白酶的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了蛋白酶的等电点,为草菇低温自溶与蛋白酶之间的关系的研究奠定了基础。     

草菇低温诱导蛋白分离纯化及其部分性质的测定

采用硫酸铵分级沉淀和制备电泳分离技术,从低温处理过的草菇菌丝中分离纯化得到三种低温诱导蛋白,分别命名为CspDZG1,CspDZG2,CspDZG3。IEF测定了等电点,分别为3．7,4．4,4．4。SDS-PAGE结果表明,CspDZG1,CspDZG2由一条多肽组成,分子量分别为56kD,54．5kD;CspDZG3由两个亚基组成,分子量分别为54．5kD,68kD。经S.aureus V8蛋白酶酶解后,测定了N端氨基酸序列。     

草菇低温诱导基因的分离

应用ｍＲＮＡ差别筛选法,对低温处理草菇及正常草菇基因表达进行筛选,分析,结合斑要交技术加以验证,分离得到草菇低温诱导基因,研究表明草菇菌丝体在低温腔胁迫下,存在着基因表达的变化。     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3'锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇(Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。     

草菇低温驯化研究

通过低温驯化,选育出一株耐低温草菇GV34。该菌株菌丝生理特性与出发菌株有较明显差异:抗逆性强,耐低温性能稳定,是适应北方地区栽培,产量高而稳定,商品性状好的优良菌株。     

草菇低温诱导蛋白分离纯化及其部分性质的测定*

采用硫酸铵分级沉淀和制备电泳分离技术,从低温处理过的草菇菌丝中分离纯化得到三种低温诱导蛋白,分别命名为CspDZG1 ,CspDZG2 ,CspDZG3。IEF测定了等电点,分别为3.7,4.4,4.4。SDS-PAGE结果表明,CspDZG1 ,CspDZG2由一条多肽组成,分子量分别为56kD,54.5kD;CspDZG3由两个亚基组成,分子量分别为54.5 kD,68 kD。经S. aureus V8蛋白酶酶解后,测定了N端氨基酸序列。     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3’锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇（Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。     

草菇(Volvariella volvacea)、银丝草菇(V.bombycina)原生质体分离研究

本文对草菇、银丝草菇菌丝原生质体制备的最佳条件作了探讨。结果表明,培养两天的草菇菌丝,以0.5MKCI或0.5MMgSO_(4.7)H_2O作渗透压稳定剂,1.5％Lywallzyme(v/m),35℃下酶解1.5—2小时,原生质体产量可达1.5×10~6个/ml以上,培养3天的银丝草菇菌丝,以0.5MKCl作渗透压稳定剂,1.5％Lywallzyme,28℃酶解2—3小时,原生质体产量可达2.8×10~6个/ml以上。此研究对以后的原生质体融合育种打下了基础。     

枯草杆菌碱性蛋白酶E的纯化和性质

目前国内外研究较多的是地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)碱性蛋白酶Carlsberg和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)碱性蛋白酶BPN’的纯化。鉴于蛋白酶E和蛋白酶BPN’在结构上有15％的非同源性,故我们用修饰纯化蛋白酶BPN’的方法来纯化蛋白酶E(subtilisin E)。     

mRNA差别显示技术分离草菇低温诱导基因*

本文报道采用改良的mRNA差别筛选法,通过选用3'锚定引物和18-25碱基的PCR随机引物组合,以琼脂糖凝胶电泳,EB显色替代聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影,对低温处理草菇(Volvariella volvacea)及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合RNA斑点杂交技术加以验证,分离得到70个草菇低温诱导DNA片段。     

草菇减数分裂和担孢子形成细胞核行为

本文用苏木精染色和双苯并咪唑(Hoechst 33258)染色法,从草菇子实体“纽期”菌褶分化完开始,每3小时对同一个子实体连续切取菌褶进行染色观察。结果表明草菇子实体“纽期”菌褶形成时,约10％的担子发生了核配;在子实体发育过程中,尤其是子实体成熟期后,不断有少量新的双核担子产生,并发生核配,使草菇减数分裂的同步性不高;草菇从菌褶分化完成(此时已有10％担子发生核配)到子实体完全成熟,菌褶变成深粉红至褐色(此时约70％担子完成减数分裂)需要28—30小时;担子减数分裂的持续时间为18小时,其中细线期和偶线期5.9小时、粗线期6.2小时、双线期和终变期3.4小时、中期10.5小时、后期Ⅰ到四分体2小时;经过对粗线期、双线和终变期以及中期Ⅰ染色体条数的多次反复观察,认为草菇的染色体条数为11(n=11);减数分裂后,4个子核分别进入4个担孢子中,留下无核的担子;绝大部分担孢子是单核的,有约5％的担孢子是双核的。     

草菇低温诱导基因的分离

应用ｍＲＮＡ差别筛选法,对低温处理草菇（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌａｖｏｌｖａｃｅａ）及正常草菇基因表达进行筛选、分析,结合ＲＮＡ斑点杂交技术加以验证,分离得到草菇低温诱导基因。研究表明草菇菌丝体在低温胁迫下,存在着基因表达的变化。     

草菇耐低温菌株的诱变选育与鉴定

在草菇V23原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体。分别用紫外线(UV),60Co-γ射线,硫酸二乙酯(DES)对原生质体进行复合诱变。初筛、复筛获得耐常规低温(4℃)10d的菌株VH。栽培实验证明:VH在26℃下的生物学效率明显优于V23(CK),且差异极显著。同工酶分析表明:VH过氧化物同工酶,酯酶同工酶谱带数量及酶活性均发生变化;RAPD实验显示:VH相对于V23的变异系数为0.213。VH菇体正常,味道鲜美,食用后无毒副作用。氨基酸组成分析表明:除总氨基酸和谷氨酸含量VH高于V23外,其它氨基酸差异不明显。VH遗传性状稳定,是具有潜在应用价值的优良菌株。     

基因文库的鉴定和应用

由于草菇是一种同宗结合的食用真菌,这给草菇的杂交育种带来了一定的困难。本文在建立草菇部分基因文库的基础之上,对草菇的基因文库进行了鉴定。在草菇基因文库中任意抽取72个克隆,利用专一的PCR方法,测出在草菇基因文库中,草菇基因组DNA的平均大小为1156个碱基对。在基因文库中任意选择53个克隆,利用专一的PCR进行DNA扩增以及dig非同位素标记,用于和草菇基因组DNA杂交。在测试的53个克隆中有8％的高度重复序列,36％中度重复序列和56％的低度重复序列。     

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A PROTEINASE FROM THE PROBIOTIC Lactobacillus rhamnosus OXY

A proteinase produced by the human gastrointestinal isolate Lactobacillus rhamnosus strain OXY was identified and characterized. The prtR2 gene coding for proteinase activity was detected in the examined strain. The PCR primers used were constructed on the basis of the sequence of the prtR2 proteinase gene from Lactobacillus rhamnosus GG. The enzyme was purified by fast protein liquid chromatography (FPLC) using CM-Sepharose Fast Flow and Sephacryl S-300 columns. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed that the enzyme had a relatively low molecular mass of 60 kD. Protease activity was observed at a pH range from 6.5 to 7.5 with optimum k _cat/K _m values at pH 7.0 and 40°C. Maximum proteolytic activity (59 U mL^?1) was achieved after 48 hr of cultivation. The activity of the enzyme was inhibited only by irreversible inhibitors specific for serine proteinases (PMSF and 3,4-dichloro-isocumarine), suggesting that the enzyme was a serine proteinase. Proteinase activity was increased by Ca²⁺ and Mg²⁺, and inhibited by Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, and Fe^2+.