巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植

将GFPmut2质粒中的gfp基因 (编码绿色荧光蛋白)克隆到载体pVK100中,构建成重组质粒pVK1001.将pVK1001通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu62中,获得GFP标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株.用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米(农大3318)幼苗,在接种后8 d、12 d,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测,结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙.用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明,大多数细菌主要定植于根表,少数菌可进入玉米根组织内.     

固氮作用

862711.巴西固氮特螺菌SP7的glnA基因的克隆和特性〔会,英〕/Fogher,C.…了Abs.6th Internatl.Sym.Nitrogen Fixa-t ion。一1985。一8一12 用广谱寄主范围的装配型质粒pVK100构建了巴西固氮螺菌(A:ospirillom brasi-lense)Sp7的总DNA基因文库。分离T能与该菌谷氨酞胺营养缺陷型突变株7029互补的克隆,称为     

巴西固氮螺菌中吸氢酶基因同源性的分子检测

通过TTC(2 ,3,5 氯化三苯基氮唑 )实验筛选出 12株能产生吸氢酶蛋白 (Hup+ )的巴西固氮螺菌 (Azospir rilumbrasilense)菌株。用Qiagen柱分离提纯含豌豆根瘤菌的hup基因片段的质粒 pHVT10 9和pHVT115 ,并用地高辛标记法标记pHVT115 ,与 12株Hup+ 巴西固氮螺菌的总DNA进行斑点杂交 ,结果显示pHVT115所含的吸氢酶基因 (hup基因 )片段与巴西固氮螺菌的大部分菌株的hup基因同源性不强。这一结果表明hup基因在固氮生物中存在着遗传多样性 ,异源hup基因探针不一定都适宜于探测hup基因。     

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植

将GFPmut2质粒中的gfp基因(编码绿色荧光蛋白)克隆到载体pVK100中,构建成重组质粒pVK1001。将pVK1001通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu62中,获得GFP)标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株。用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米(农大3318)幼苗,在接种后8d、12d,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测,结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙。用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明,大多数细菌主要定植于根表,少数菌可进入玉米根组织内。     

巴西固氮螺菌Yu62 nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD－PCR法克隆了巴西固氮螺菌（Azospirillun brasilense)Yu62和nifA基因。序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源（96．5％）,其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97．6％。该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA^-突变株的Nif^-表型。研究了NH4^ 和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响。结果表明：nifA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl4与微氧（0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%-0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性。     

巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定殖研究

以质粒pEGFP-C1为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因全长序列,将其与原核表达载体pVK-100连接,构建成重组载体pVK-EGFP.利用电转化法将重组载体导入巴西固氮螺菌Yu62中,得到EGFP标记菌株.用EGFP标记菌接种小麦'小偃107'种子,室内限菌条件下培养10 d后,用荧光显微镜观测标记菌在小麦体内的定殖规律并观察接菌植株的田间生长状况.结果显示,巴西固氮螺菌Yu62能定殖于小麦根毛区、茎组织的细胞间隙等部位,而且接菌小麦'小偃107'植株在根系发育、株高、分蘖数等方面比对照有较明显的优势.研究表明,巴西固氮螺菌Yu62能够定殖于小麦根茎内,并具有促进植物生长的作用.     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分泌菌株的筛选

以携带质粒pAM120(Ap~r,Tc~r/Tn916)的大肠杆菌(E.coli CG120)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)采用滤膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子(10~(-5)/每个供体菌,选择四环素抗性)。从846株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株3株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达7.5～14.0mmol/L。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源上的固氮活力,发现20mmol/L NH Cl的存在不抑制其固氮活性,固氮活力与无氮条件下野生株的活力相差不多。无选择压力下细胞分裂50代后的稳定性实验证明,转座子Tn916在氨分泌突变株中的稳定性在50％～80％之间。以固氮螺菌氨分泌突变株为供体菌株,对E.coli HBX1进行反向接合转移实验,证实Tn916确实存在于氨分泌固氮螺菌接合子中。     

生物固氮

961447 肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用[中]/何路红…//生物工程学报.-1995,11(4).-385～388 按三亲交配法将pCK3转入巴西固氮螺菌UB3     

巴西固氮螺菌Yu62glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中,筛选到glnB基因的阳性克隆,将3.7kb/EcoRI PstI的阳性克隆亚克隆到pUC19中,进行了全序列分析,其在GenBank中的登记号是AF323960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶（GS）的glnA基因,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长336bp,编码112个氨基酸,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达71%、77%、79%和69%。将卡那霉素抗性片段（Km-cassette)插入glnB基因的BglII位点,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中,通过同源重组,获得GlnB^-突变株（glnB::Km）。为进一步分析glnB基因的功能,将glnB基因的编码区（339bp）构建在pVK100中,置于Km启动子下组成型表达,形成重组质粒pVK-II。将重组质粒pVK-II转入到GlnB^-突变株,构建成互补株C-glnB(glnB:Km/glnB)。对GlnB^-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明,GlnB^-突变体无固氮酶活性,即表型为Nif^-;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK-II分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT^-突变标中,使glnB基因的拷贝数增加,并进一步比较它们的固氮酶活性,结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性。     

巴西固氮螺菌Yu62由水稻和烟草根部向茎、叶的迁移运动

巴西固氮螺菌(Azospirillrm brasilence)是重要的植物促生内生菌之一.用gfp基因标记固氮螺菌后接种无菌的水稻和烟草幼苗的根部,限制培养一定时间后,用共聚焦激光显微镜观察,结果表明:除了根部有发荧光的螺菌定殖外,螺菌还分布在茎、叶的表皮细胞,皮层细胞和维管系统组织的细胞间隙.从根、茎、叶器官分离固氮螺菌,都存在有较高的螺菌群体密度.这一结果证明螺菌在植物内存在着从根部向茎、叶顶端的迁移现象.这一发现为研究巴西固氮螺菌在窠主植物体内的迁移运动的机制、与植物细胞间的分子相互作用及其对植物的促生作用奠定了生态学和细胞形态学的基础,也为实际应用提示了进一步的科学依据,具有重要的科学和实践意义.     

肺炎克氏杆菌NifA对巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用

用PR方法克隆了巴西固氮螺菌Yu62 nifH的启动子片段,DNA序列分析表明菌株Yu62与标准菌株sp7之间的DNA序列差异很小。利用启动子探针质粒载体pcBl82,构建了3个不同的nifH：：lacz转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌NifA对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌nifH启动子的转录是依赖于NifA的,缺失了上游激活序列的启动子不能被NifA激活转录,肺炎克氏杆菌NifA对其自身nifH及巴西固氮螺菌nifH启动子的转录激活作用并无很大差异。     

巴西固氮螺菌的周质蛋白与宿主相关性的研究

本文报道用一种微量的方法研究从小麦、玉米、水稻、谷子等作物根系分离到的30株巴西固氮螺菌的周质蛋白。结果表明:尽管经形态、生理生化等多项指标鉴定确认它们同属于Azospirillum brasilcnse (巴西固氮螺菌),但是来源于不同植物根表的菌株间的周质蛋白扫描图谱有明显的差异,而来自同一种作物根表的菌株间的周质蛋白图谱却很相似。从而表明,巴西固氮螺菌具有宿主特异性。     

巴西固氮螺菌的周质蛋白与宿主相关性的研究*

本文报道用一种微量的方法研究从小麦、玉米、水稻、谷子等作物根系分离到的30株巴西固氮螺菌的周质蛋白。结果表明:尽管经形态、生理生化等多项指标鉴定确认它们同属于Azospirillum brasilcnse (巴西固氮螺菌),但是来源于不同植物根表的菌株间的周质蛋白扫描图谱有明显的差异,而来自同一种作物根表的菌株间的周质蛋白图谱却很相似。从而表明,巴西固氮螺菌具有宿主特异性。     

巴西固氮螺菌Yu62由水稻和烟草根部向茎、叶的迁移运动(英文)

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilence)是重要的植物促生内生菌之一。用gfp基因标记固氮螺菌后接种无菌的水稻和烟草幼苗的根部,限菌培养一定时间后,用共聚焦激光显微镜观察,结果表明:除了根内部有发荧光的螺菌定殖外,螺菌还分布在茎、叶的表皮细胞,皮层细胞和维管系统组织的细胞和细胞间隙。从根、茎、叶器官分离固氮螺菌,都存在有较高的螺菌群体密度。这一结果证明螺菌在植物内存在着从根部向茎、叶顶端的迁移现象。这一发现为研究巴西固氮螺菌在宿主植物体内的迁移运动的机制、与植物细胞间的分子相互作用及其对植物的促生作用奠定了生态学和细胞形态学的基础,也为实际应用提供了进一步的科学依据,具有重要的科学和实践意义。     

巴西固氮螺菌ntrBC基因的克隆与核苷酸序列分析

以EMBL3为载体,构建了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的基因文库.以巴西固氮螺菌Yu62中PCR扩增出的450bp DNA 片断作为探针,对该基因文库进行筛选,得到了10个阳性克隆(EA1—EA10),其中含有两种不同类型的克隆,分别以EA4和EA9为代表.对EA4的杂交分析发现目的基因位于2.9kb EcoRI片段上.DNA序列分析结果表明该片段含有完整的ntrC编码区,其编码产物由480个氨基酸组成.分子量为53469;ntrC上游是完整的ntrB编码区,其编码产物由400个氨基酸组成,分子量为43487.对相应的NtrC和NtrB氨基酸序列进行同源性分析,说明巴西固氮螺菌与根瘤菌的亲缘关系较与其它自生固氮菌的更为接近.     

肺炎克氏杆菌NifA对巴西固氮 螺菌nifH启动子的转录激 作用

用ＰＣＲ方法克隆了巴西固氮螺菌Ｙｕ６２ｎｉｆＨ的启动子片段,ＤＮＡ序列分析表明菌株Ｙｕ６２与标准菌株Ｓｐ７之间的ＤＮＡ序列差异很小。利用启动子探针质粒载体ｐＣＢ１８２,构建了３个不同的ｎｉｆＨ１ａｃＺ转录融合质粒,在大肠杆菌中分别测定肺炎克氏杆菌ＮｉｆＡ对它们的转录激活作用。结果表明巴西固氮螺菌ｎｉｆＨ启动子的转录是依赖于ＮｉｆＡ的,缺失了上游激活序列的启动子不能被ＮｉｆＡ激活转录,肺炎克氏杆菌Ｎ     

巴西固氮螺菌 Yu62 draTG 基因启动子区域的核苷酸序列及其功能分析

对巴西固氮螺菌ｄｒａＴＧ上游区域进行了全序列分析,结果表明该区域除了编码部分ｎｉｆＨ基因外（ｎｉｆＨ与ｄｒａＴＧ转录方向相反）,不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列,它们包括上游激活序列（ＵＡＳ）、下游启动子组份（ＤＰＥ）和富Ａ＋Ｔ区。这说明：ｎｉｆＨ与ｄｒａＴ间的区域可能主要起调控功能而非编码功能;ｄｒａ操纵元（ｏｐｅｒｏｎ）的启动子很可能是ＲｐｏＮ－依赖型。用ｐＡＦ３００做载体,构建了ｄｒａＴ∷ｃａｍ转录融合质粒ｐＡＴ１,并通过检测Ｃｍｒ以检测ｄｒａＴ在大肠杆菌和巴西固氮螺菌中的表达,结果表明ｄｒａＴ在ＬＤ丰富培养基上,好氧条件下,只在巴西固氮螺菌中才表达。这说明,ｄｒａＴ的转录需要某种大肠杆菌中没有的因子,同时也表明ｄｒａＴＧ上游区域有启动子功能。利用启动子探针质粒载体ｐＣＢ１８２,构建了ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ转录融合质粒ｐＣＴ１。在大肠杆菌中测定肺炎克氏杆菌ＮｉｆＡ对ｄｒａＴ∷ｌａｃＺ的转录激活作用。结果表明ｎｉｆＡ并不参与ｄｒａＴ的转录调控。     

转座子Tn916对固氮螺菌Azospirillum brasilense的接合诱变及氨分 …

以携带质粒ｐＡＭ１２０（Ａｐ＾ｒ,Ｔｃ＾ｒ／Ｔｎ９１６）的大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＧ１２０）为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌采用膜接合法进行接合转移,在选择平板上得到具较高频率的接合子（１０＾－５／每个供体菌,选择四环素抗性）。从８４６株四环素抗性接合子中进一步用奈氏法筛选得到氨分泌突变株３株。在无氮培养基上,其氨分泌量可达７．５￣１４．０ｍｍｏｌ／Ｌ。用乙炔还原法分析氨分泌突变株在不同浓度氮源     

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。