人工栽培蛹虫草退化现象的分子分析*

利用PCR-RFLP和RAPD方法对野生驯化蛹虫草及其退化菌种进行了基因水平的分析。PCR-RFLP实验,采用真菌通用引物ITS1和ITS4,扩增出5.8S和其两端的两个转录间隔区(ITS),选用5种识别四个碱基的内切酶(HaeIII、AfaI、TagI、AluI和XspI),其中只XspI酶切结果在两个菌种中存在差异,进一步测序表明,整个片段全长534bp,共有13个位点发生碱基突变,且都为c转换为t。RAPD实验,选用4组计80个随机引物进行PCR扩增,共筛选出9个对所有供试个体均存在明显差异的引物。结果表明了退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变,这些突变可能直接与导致菌种退化的基因相关联。     

阴道分离因肯毛孢子菌的分子鉴定和种内分型

分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS1)测序,ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法,对三株因肯毛孢子菌Trichosporon inkin进行分子特征及种内分型研究。结果显示,不同菌株的rRNA基因ITS区和IGS1区的序列相似性均高达100%,RFLP酶切图谱具有较理想的种内一致性,而不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明:rRNA基因IGS1区测序及RFLP酶切可考虑用于因肯毛孢子菌的菌种分子鉴定,而基因组DNA的RAPD则较适合于菌种的种内分型。     

捕食线虫真菌rDNA ITS区间RFLPs分析

利用PCR-RFLP方法对捕食线虫真菌进行了系统发育研究。以ITS1和ITS4为引物对3属14种16个菌株的核糖体DNA转录间区（ITS）进行了PCR扩增,4种内切酶（AluI、HaeIII、HpaII、TaqI）酶切,结果表明不同属的ITS区长度没有明显差异,其长度范围在585～695之间。酶切图谱种间差别明显,种内基本一致,同属菌株图谱没有特异性,暗示传统的分属可能过细,某些属的成立还有待商榷,PCR-RFLP对确定疑难种的地位有重要意义,但不适用于种下水平的系统学研究。     

应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性

通过保守的寡核苷酸引物B1/B3扩增出油菜菌核病菌MBCHR和MBCS菌株的部分β-微管蛋白基因,结果发现编码的198位氨基酸由Glu(GAG)突变为Ala(GCG),表现高水平抗药性。根据MBCHR菌株的突变设计2个快速检测方法:第一种方法是根据MBCHR菌株197和198位密码子(GACGAG→GACGCG)形成ThaI酶切位点(3’CGCG 5’),将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段,而MBCS菌株的PCR产物不被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3’末端碱基设计2个等位基因特异性寡核苷酸引物(ASO)用于“nested”PCR或直接从基因组DNA扩增。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测油菜菌核病菌的MBCHR和MBCS菌株,所得结果与传统菌落直径法相吻合。     

应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性*

通过保守的寡核苷酸引物B1/B3扩增出油菜菌核病菌MBCHR和MBCS菌株的部分β-微管蛋白基因,结果发现编码的198位氨基酸由Glu(GAG)突变为Ala(GCG),表现高水平抗药性。根据MBCHR菌株的突变设计2个快速检测方法:第一种方法是根据MBCHR菌株197和198位密码子(GACGAG→GACGCG)形成ThaI酶切位点(3’CGCG 5’),将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段,而MBCS菌株的PCR产物不被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3’末端碱基设计2个等位基因特异性寡核苷酸引物(ASO)用于“nested”PCR或直接从基因组DNA扩增。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测油菜菌核病菌的MBCHR和MBCS菌株,所得结果与传统菌落直径法相吻合。     

应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性

通过保守的寡核苷酸引物B1/B3扩增出油菜菌核病菌MBC^HR和MBC^S菌株的部分β-微管蛋白基因,结果发现编码的198位氨基酸由Clu(GAG)突变为Ala(GCG),表现高水平抗药性。根据MBC^HR菌株的突变设计2个快速检测方法：第一种方法是根据MBC^HR菌株197和198位密码子（GACGAG→GACGCG）形成HhaI酶切点（3'CGCG 5'）,将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段,而MBC^S菌株的PCR产物不被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3'末端碱基设计2个等位基因特异性寡核苷酸引物（ASO）用一地“nested”PCR或直接从基因组DNA扩增。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测油菜菌核病菌的MBC^HR和MBC^S菌株,所得结果与传统菌落直径法相吻合。     

用分子生物学技术对草菇进行菌株鉴别

利用AP-PCR和RAPD技术对三个草菇菌株进行鉴别,其结果与用草菇菌株V34基因文库中的中等重复序列为探针进行限制性内切酶长度多态性分析(RFLP),及对编码核糖体5.8SrRNA的DNA(rDNA)进行PCR扩增后的产物进行限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RFLP)的结果相一致。这一结果显示出用这四种方法对草菇菌株进行鉴别具有相似的效果。同时用这四种方法构建的分子生物学标记显示出这三个菌株中的两个菌株在遗传上有着较大程度的相似性。     

分子标记对草原野生食用菌蒙古口蘑的鉴别分析

对采自内蒙古锡林郭勒草原的野生食用菌蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai.)等10个菌种进行了ITS和ISSR分子标记的鉴定,其中蒙古口蘑共计4个不同来源菌种,其它6个菌种为子实体与蒙古口蘑形态相近的常见草原菇类或市售食用菌,鉴定结果用RAPD进行辅助分析验证。从12条ISSR引物中筛选出2条可用引物,扩增总条带数为246条,多态性标记为215个,多态性频率为87.4%。经过NT-SYS软件聚类分析,发现在ISSR分析中结合ITS方法可以有效地将蒙古口蘑与其它菌种区分开,这与RAPD法的分析结果相一致,获得了可靠的野生食用菌分子标记方法。研究表明ISSR分子标记是蒙古口蘑等野生食用菌鉴定的理想手段之一。     

海藻糖合酶产生菌筛选、鉴定及目的基因克隆

目的:为筛选出一株产海藻糖合酶的菌株,并以此菌的全DNA为模板,克隆出产海藻糖合酶的目的基因片段。方法:实验过程中采用了常规筛选菌种、快速提取细菌全基因、显微镜观察菌种、热启动PCR技术、电泳纯化回收基因片段、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段等方法。结果:在电镜下可观察到有芽孢、杆菌;菌株16S rRNA基因扩增产物共计1490个碱基;PCR方法扩增出阳性克隆大约1700bp的基因片段。结论:通过生理、形态、结构特征分析及16S rRNA基因全序列比较得出结论:筛选到一株短小芽孢杆菌;PCR扩增出阳性克隆片段,全长1722bp,为实验所要的编码海藻糖合酶的基因片段。     

PCR-RFLP 方法测定 ras 癌基因点突变

曾使用 PCR-RFLP 方法分析过 c-Ha-ras 癌基因第12密码子的点突变.因N-ras 基因第12位密码子、K-ras 基因第12和13位密码子无已知的限制性内切酶的酶切位点,不能使用 PCR-RFLP 方法分析这些位点的突变.在 PCR 引物的3′端引入一个误配的碱基使之正好成为某限制性内切酶的酶切位点,这样便能使用PCR-RFLP 技术分析 c-Ha-ras 基因第61位、N-ras 基因第12位、K-ras 基因第12和13位密码子的点突变.     

氮离子诱变筛选内切葡聚糖酶高产菌株及其基因突变研究

目的：离子注入枯草芽孢杆菌筛选高产内切葡聚糖酶突变菌株,同时进行其酶活性研究,并克隆该基因,研究离子注入对其诱变效应。方法：低能氮离子重复注入枯草芽孢杆菌,筛选获得1株高产内切葡聚糖酶突变菌株Bac11。DNS法测定酶活性。PCR扩增获得出发菌株Bac01和突变菌株Bac11内切葡聚糖酶基因,并对核酸序列及预测氨基酸序列进行多重比对。结果：突变菌株Bac11内切葡聚糖酶活性从93.33IU提高到381.89IU。多重比对Bac01和Bac11内切葡聚糖酶基因编码区1500bp序列,当中有10个碱基发生突变,预测氨基酸序列中有5个氨基酸残基发生变化,且都在其基因纤维素结合域部分。结论：低能氮离子重复注入对枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶活性及其基因有明显的诱变累加效应。     

PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究

目的建立检测常见丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP和多重PCR方法。方法建立以PCR技术为基础的限制片段长度多态性(RFLP)方法 ,首先用真菌通用引物扩增丝状真菌的ITS区,然后用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切。用4种丝状真菌的特异性引物建立多重PCR体系,用该体系检测单模板、双模板和三模板的扩增情况,并测定该体系的特异性和敏感性。结果用PCR-RFLP技术能够鉴别5种常见丝状真菌,多重PCR能够根据扩增片段的不同鉴别菌种,在合适的反应条件下,对单模板、双模板和三模板均能扩增出目的片段。结论 PCR-RFLP和多重PCR技术能够快速鉴定丝状真菌感染病原菌,有临床应用的良好前景。     

两株假单胞菌菌株的RAPD分析及分子生物学鉴定

根据DNA随机扩增多态性(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,简RAPD)分子标记技术设计鉴别引物,建立一种快速、准确检测病人体内新发现的假单胞菌菌株的分子生物学方法.采用RAPD分析方法对该菌种的对照菌株AcinetobactercalcoaceticusKHW14(简称A.calcoaceticusKHW14)和新分离的菌株Acinetobactercalcoaceticus(简称A.calcoaceticus)进行指纹分析,依据两菌株的差异序列设计两对引物,并建立最佳的PCR扩增体系,产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳得菌株特异性电泳图谱.此图谱可作为鉴定两菌株的标准图谱,RAPD分析方法具有良好的重复性,同时也进一步验证了两菌株的同源性.     

大豆疫霉根腐病菌的rDNA ITS序列分析

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物,PCR扩增了大豆疫霉根腐病菌具有差异的17个菌株的ITSI与ITS2,经过与DL2000的标准分子量DNA进行比较,得到了大约800~1000bp左右的片段,并对PCR产物进行了序列测定。以USA为外类群利用最大简约法构建了大豆疫霉根腐病菌的系统发生树,并分析了菌株之间的遗传进化关系。结果表明:不同菌株ITS1和ITS2在碱基构成上有很大差异,17个菌株大致分为4个谱系中,且来自于同一地区的菌株大都分布在同一谱系中,显示出地理上的差异。     

基于香菇菌株rDNA-ITS序列的系统发育分析

根据真菌核糖体通用引物ITS1和ITS4扩增出13个福建袋栽香菇主要菌株的5.8S rDNA、ITS序列,对该序列进行测序后,得到完整的5.8S rDNA、ITS序列,将该序列提交NCBI并获得登录号,对该序列进行比对分析并构建了系统发育树,从分子水平对香菇菌株进行了区分鉴定,结果显示13个菌株可以明显的分成2丛,而其他菌株又可以从一丛中延伸出几个亚丛。     

应用RAPD技术鉴别微生态菌种

目的：建立应用RAPD技术鉴别微生态菌种的方法,提高菌种鉴别水平。方法：应用RAPD（随机扩增多态性）方法,选用5条随机引物,利用PCR方法,对3株长双歧杆菌,3株嗜酸乳杆菌,3株粪肠球菌进行基因组DNA指纹图谱分析。结果：发现不同菌株扩增的DNA片段的大小、数量是有差异的。结论：此方法具有可重复性,方便、快速和准确的优势,可用于微生态制剂生产用菌株的鉴别。     

DNA指纹图谱鉴别双歧杆菌的研究

采用RAPD技术选用10条引物对7种9株双歧杆菌基因组DNA进行PCR扩增,根据在优化条件下所得DNA指纹图谱分析了双歧杆菌菌株的遗传多样性,并构建了相似性指数矩阵和树状图.结果表明,不同序列的随机引物可扩增不同形式的RAPD图谱,但并非所有图谱都具有分类学意义,其中引物S256对双歧杆菌种及同种不同菌株均具有良好的区分能力,由该引物扩增的RAPD图谱计算出的相对性指数矩阵以及由此构建的聚类树状图均能正确地反映出双歧杆菌的系统发育关系,同时对RAPD图谱作为工业双歧杆菌分子标记的可能性进行了探讨.     

羊肚菌栽培菌株遗传多样性分析及种特异性RAPD-SCAR标记开发

近年来中国的羊肚菌Morchella spp.栽培技术取得了长足进步,但基础研究薄弱影响其稳产和高产,国内外尚无羊肚菌栽培菌株种质资源遗传多样性的研究报道。本文对来自全国12省份的36个羊肚菌栽培菌株进行了ITS系统发育分析,并采用RAPD进行了遗传多样性评价。结果表明,结合有效的参考菌株序列,通过ITS序列分析可以将供试菌株进行区分和鉴定,在36个菌株中,26个菌株属于梯棱羊肚菌Morchella importuna,其他10个菌株属于六妹羊肚菌M. sextelata;将自40条RAPD引物中筛选出的14条用于供试菌株遗传多样性分析,共扩增出124条多态性条带;UPGMA聚类可将供试菌株分为两大类群,分别对应于ITS系统发育分析中的梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌两个物种,梯棱羊肚菌种内菌株多态性高于六妹羊肚菌。OPA17引物和OPA18引物分别在AA02和AA15菌株中扩增出具有唯一性的特征条带,对两个特征条带进行回收测序后,设计出两个特异性SCAR的引物,它们能有效地从36个供试菌株群体中将菌株AA02和AA15鉴别出来。本文首次全面系统地采用ITS分析鉴别了我国羊肚菌栽培菌株的种性,采用RAPD分子标记系统地评价了羊肚菌栽培菌株的遗传多样性,并验证了RAPD分子标记转化为菌株特征性SCAR标记的可行性。     

稗草致病菌——尖角突脐孢菌菌株RAPD指纹图谱的分析

以我国主要稻区的稗草植株上分离的17株尖角突脐孢菌菌株为试验材料,采用改良的SDS法提取其基因组DNA,并运用优化的RAPD分析体系对其进行了分子标记遗传差异研究。从25个随机引物中筛选出20个扩增效果好的引物,对全部试验材料进行了RAPD扩增,共得到239条有效带,其中多态性带229条（占95.8%）。依据扩增结果建立了17株尖角突脐孢菌基因型的DNA指纹图谱并对其进行了有效区分。根据RAPD分析结果计算了菌株间的遗传距离,分析了它们的遗传差异并进行了聚类分析,结果表明,RAPD分子标记技术是能够用于杂草致病菌资源的鉴定的,并可以进一步应用于特定性状的基因标记研究。     

离子注入诱变莲花突变体分子机理的初步研究

低能离子注入技术作为生物物理诱变的一种新型技术, 在园艺植物育种方面具有很大的应用潜力, 但其诱变的分子机理目前知之甚少。文章对Fe+ 离子注入诱变的白洋淀红莲(Nelumbium speciosum Willd)突变体及其对照的基因组进行RAPD研究, 并将突变体和对照在辐射敏感位点的条带进行克隆测序及DNA序列分析。在已优化好的RAPD体系下扩增, 从110条随机引物中筛选出了10条可以稳定扩增出显著特异条带的引物, 引物多态性为9.09%。将这10条引物扩增出的辐射敏感位点的条带进行克隆测序, 并进行序列比对。结果显示: 突变体的总碱基突变频率为0.87%, 6个突变体的碱基突变频率存在着差异; 碱基突变类型包括碱基的颠换、转换、缺失、插入, 在检测到的159个碱基突变中, 单碱基置换的频率(61.01%)高于碱基插入或者缺失的频率(38.99%), 在碱基置换中, 转换的频率(44.65%)是颠换频率(16.35%)的2.7倍, 其中C/T之间的转换所占比例最大, A→G和A→T也具有较高的替换频率; 构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱变发生变异, 除了没有C→G的置换外, 每一种碱基都可以被其他的几种碱基所置换, 但是胸腺嘧啶(T)具有较高的辐射敏感性。通过对碱基突变位点周边序列的分析发现, 嘌呤突变位点的周围嘌呤碱居多, 嘧啶突变位点的周围嘧啶碱居多。研究结果为揭示低能离子注入诱变作用分子机理提供了依据。