花粉管通道法介导PRSV-CP基因dsRNA转化番木瓜

以番木瓜‘蔬罗Ⅰ号’植株为受体材料,采用花粉管通道技术将番木瓜环斑病毒外壳蛋白(PRSV-CP)基因3′-端同源序列dsRNA转入番木瓜子房中。用PCR方法对T0代种子进行了分子检测,获得53株转基因番木瓜,转化率达到8.9%;对获得的T0代转基因番木瓜进行了田间抗病性鉴定,结果表明,转基因番木瓜植株对番木瓜环斑病毒(PRSV)表现为不同程度的抗性,可以推迟发病。     

菲对转基因番木瓜进行大田种植试验

AgBiotech Reporter2005年22卷3期17页报道：已知环斑病毒是多年来美国夏威夷州番木瓜种植业减产的严重病害。近据菲律宾的非赢利机构菲律宾生物技术联合会（BCP）主席BienvenidoPecson博士宣称,为防止环斑病毒对番木瓜的危害,菲律宾正在培育可有效地抵抗环斑病毒的新的转基因番木瓜品种,并批准对其进行大田种植试验。此外,菲律宾农业、林业和天然资源研究和开发委员会（PCARRD）的科学家已对上述品种的基因进了鉴定。     

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。     

几种化学制剂对番木瓜抗环斑病毒和防御酶活性的影响

研究几种化学制剂对番木瓜抗环斑病毒和叶片中防御酶活性影响的结果表明,接种番木瓜环斑病毒后,植株叶中多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性均明显升高,其中PPO和POD总体的升高幅度大,SOD的总体升幅较小;病毒必克的升幅较大,83增抗剂和水杨酸的升幅较小。83增抗剂、水杨酸和病毒必克均能使番木瓜叶中PPO、SOD和POD活性持续升高,有效减轻了环斑病的病情,防治效果依次为83增抗剂〉水杨酸〉病毒必克。     

转基因番木瓜研究进展

番木瓜环斑病毒 (PRSV)使热带亚热带的重要水果番木瓜的生产受到严重影响 ,在众多方法防效不佳的情况下 ,利用病原获得抗性防治PRSV给番木瓜的生产带来了光明。综述了近年来转PRSVCP基因番木瓜中影响番木瓜转化因素和转基因番木瓜的抗性因素。转PRSV外壳蛋白 (CP)基因的番木瓜中多以胚性组织为转化材料 ,被转化材料的生理状态和基因型 ,是影响转化效率和转基因植株质量的主要因素。所获得的转基因番木瓜对PRSV的抗性在很大程度上依赖于接种PRSV与所转化PRSVCP基因的序列同源性、转基因拷贝数和所转基因的位置等。     

番木瓜环斑病毒分离物(SM)外壳蛋白基因克隆及序列分析

番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus简称PRV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus group)的成员之一。PRV严重危害我国的番木瓜生产,流行年间甚至达到毁灭性程度。60年代以来,我国番木瓜因受PRV危害,已从多     

番木瓜环斑病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型上的初步应用

本试验是用番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRV)提纯制剂免疫的BALB/c小白鼠脾细胞与Sp~2/o-Ag14骨髓瘤细胞融合,获得三个能稳定传代并分泌抗番木瓜环斑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中23H1 McAb的效价较高,用ELISA检测,腹水抗体效价高达1:76800,能被PRV兔抗血清所阻断。这3个杂交瘤细胞系产生的单抗与TMV和CMV无血清交叉反应。它们可把PRV四个毒株初步区分为三个血清型。     

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT－PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒（PMaLV）的外壳蛋白（CP）基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System（简称T－载体）,并进行了序列分析。结果表明,PMaLV CP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸。与番木瓜环斑病毒（PRSV）美国夏威HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96％、98％、95％、89％和89％。其的氨基酸序列同源率分别为98％、97％、97％、96％和95％。此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒。因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系（ML株系）。     

番木瓜环斑病毒弱株系保护作用的研究

本文报道了在番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）弱株系保护作用中,保护接种与攻击接种的深度,以及攻击接种的部位等因素对ＨＡ５－１弱株系保护作用效果的影响结果。通过分析弱株系和强株系在保护接种后攻毒的植株体内的病毒浓度,表明ＨＡ５－１弱株系对Ｓｍ株系的保护作用的崩溃是由于强株系在植株顶端叶片听病毒浓度越来越高所致。本文还就ＰＲＶ弱株系在田间的应用技术作了一些讨论。     

番木瓜的组织培养繁殖

多年来,南佛罗里达州的番木瓜生产由于受到卷曲圆斑病毒的影响而受到限制。为获得耐病毒植株繁殖而进行组织培养,以前有人从5—6厘米长的幼苗分离出的组织,培养在含有激动素(KT)的简单培养基上获得多育的植株。但是,对于特征已清楚的成熟番木瓜组织来说,这种处理是无效     

花粉管通道技术转化番木瓜的初步研究

以番木瓜"solo Ⅱ"号植株为受体材料,用花粉管通道法进行了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV-CP)278 bp片段的遗传转化.采用质粒DNA和农杆菌菌液两种导入液,分别处理花187和232朵,收获成熟番木瓜105和30个.座果率分别为56.15%和12.93%,随机选择每种载体的种子100粒播种.成株率分别为61%和60%.对T1幼苗(除含空载体外)全部进行PCR检测.检测结果为质粒DNA和农杆菌菌液两种导入液转化所得的幼苗阳性率分别为50.54%和51.22%.     

番木瓜环斑病毒海南分离株全基因组序列分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)的成员之一.病毒粒体呈线状,长700～900nm,直径为12.5nm.为单分体正链RNA病毒,由多种蚜虫以非持久方式传播.依寄主范围可划分为P型和W型两种.其中P型株系(PRSV-P)是制约生产的重要病原,除了给番木瓜生产带来严重危害,也会危害葫芦科作物.W型株系(PRSV-W)是危害葫芦科作物的主要病原,虽然和PRSV-P型株系血清学反应密切相关,但不侵染番木瓜.     

海南地区番木瓜花叶病病原的分子鉴定与多样性分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)和番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV)是热带、亚热带地区严重威胁番木瓜农业生产的主要病害。本研究对27份疑似番木瓜花叶病病叶样品进行分子鉴定,提取病叶总RNA,反转录获得对应的cDNA,根据PRSV病毒的CP、P1、Hc-Pro和NIb基因序列和PLDMV病毒的CP基因序列设计特异性引物进行PCR检测和测序分析。研究发现PRSV感染20例(74.1%),PLDMV感染3例(11.1%),PRSV和PLDMV交叉感染的样品1例(3.7%)。多样性分析结果表明,海南地区PRSV病毒存在3个株系,株系之间出现明显分化;海南地区PLDMV病毒与日本和台湾地区报道的PLDMV病毒株系有共同的起源。研究结果表明PRSV和PLDMV是海南地区番木瓜花叶病的主要病原,其中PRSV病毒3个株系之间P1基因同源性在95%以下,这可为后续研究构建抗PRSV和PLDMV的双价表达载体提供数据支持。     

T4转基因番木瓜遗传性和果实品质分析

对T 4代转基因番木瓜进行了分子生物学和果实品质分析,结果表明,筛选获得的转基因番木瓜均为转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶突变体基因(RP),且对PRV抗性达到了高抗或免疫,RP基因在转基因植物中能稳定遗传至后代并在RNA水平上表达。在田间种植时,转基因木瓜的生长状况普遍好于普通番木瓜,尤其在生长后期(10月以后),普通番木瓜100%发病(大规模种植时),而大部分(约91.8%)转基因植株生长良好,果实较多且表面光洁、基本上无环斑。与非转基因亲本相比,T 4代转基因番木瓜的果实长度增加2.6%~5%,果实直径变小0.6%~1.5%,果肉厚度增加了12%~15%,因而果实形状与亲本相近或更好,且信用价值更高。转基因番木瓜果实中水分、蛋白质、氮、脂肪、还原性糖、维生素A、维生素C和类胡萝卜素的含量与对照都无显著性差异,即转基因番木瓜与亲本具有实质等同性,这表明转入的外源基因对番木瓜果实品质没有不良影响。     

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT-PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒(PMaLV)的外壳蛋白(CP)基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System(简称T-载体),并进行了序列分析.结果表明,PMaLVCP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸.与番木瓜环斑病毒(PRSV)美国夏威夷HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸.与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96%、98%、95%、89%和89%.其推导的氨基酸序列同源率分别为98%、97%、97%、96%和95%.此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒.因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系(ML株系).     

番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究

建立了检测番木瓜环斑病毒 (PRV)的免疫捕捉 PCR (IC PCR)法、ELISA PCR法和巢式 PCR法 ,它们分别能从 10 - 4、10 - 7和 10 - 14 稀释度的番木瓜叶粗汁液 (所含鲜叶组织的量分别 0 .5ug、0 .5ng和 5× 10 - 6ng)中检测出PRV。     

番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因嵌合hpRNA载体一步快速构建及沉默效果的研究

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)严重威胁番木瓜种植业的发展,且目前没有十分有效的防治办法。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助,真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。以番木瓜eIF4E家族基因为研究对象,构建同时干扰其eIF4E和eIFiso4E基因的发卡RNA(hairpin RNA,hpRNA)载体,并将其导入到番木瓜叶肉原生质中。通过荧光实时定量检测发现,番木瓜中eIF4E和eIFiso4E基因的表达量分别下降了49.8%和67.6%,这为进一步研究番木瓜eIF4E家族基因对PRSV侵染的影响以及利用RNA干扰技术靶向植物基因的病毒防治新策略提供理论和实践依据。     

烟草抗黑胫病突变体的细胞筛选

经实验我们成功地建立了在细胞水平上筛选烟草抗黑胫病突变体的筛选体系。该体系的主要内容为:γ-射线500—2000拉德诱变高度感病品种的花药后用50—80％的黑胫病菌粗毒素为选择压力,筛选出抗毒素花粉植株,用离体叶片法测定选出抗病植株,再从后代鉴定中选出抗病性能够稳定遗传的突变系。γ-射线及高浓度毒素处理均能得到抗病植株。选自感病品种的花粉植株中约有9—50％是真正抗病的。这些抗病植株中有一部分的抗病性能够稳定遗传。用该法已从感病优质品种小黄金1025及乔庄黑苗中选出6个突变系。并自N.C.628(抗)×小黄金1025(感)及N.C.628(抗)×庆胜2号(感)的F_1花粉植株中选出4个抗病系。所有的抗病系经3—4代后均表现出稳定抗性。其中一个突变体(R400)的抗性似由不完全显性多基因控制。     

番木瓜环斑病毒华南强株系cDNA文库的构建及其基因组3''''端区域结构的研究

以λ-ZAPⅡ噬菌体为载体,构建了番木瓜环斑病毒华南强株系(PRV-SM)基因组cDNA文库。以PCR扩增的外壳蛋白(CP)基因为探针筛选出阳性克隆。酶谱和序列分析确定,其中两个阳性克隆除重叠部分外为长达2676个核苷酸的基因组3′端区域。其中包括棱内含体蛋白b(NIb)基因的1607个棱苷酸,CP基因的858个核苷酸和基因组3′端非编码区的211个核苷酸(不包括polyA尾巴)。PRV-SM的NIb含有依赖于RNA的RNA聚合酶的8个特征性保守序列,可能是参与基因组RNA复制的核心亚基。与其他株系比较,NIb的氨基酸变化主要集中在其C端和N端。PRV-SM 3′端非编码区有一段28个核苷酸的正向重复序列,能在其内形成茎环二级结构,并且在各株系间具有高度保守性。NIb,CP和3′端非编码区的总的序列比较表明,SM株系与国外报道的其他株系亲缘关系相对较远。     

转基因番木瓜的抗病性及分子鉴定

对T1代转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)突变体基因的两个番木瓜株系,进行了抗病性和分子生物学分析。结果表明,转基因番木瓜对PRV抗性达到高抗或免疫,目的基因RP遗传至转基因后代并在RNA水平表达,PCR可检测到CaMV35S启动子序列、标记基因NPTII。 Abstract:Virus resistance in field and molecular biological characterizations of the transgenes were analyzed for two lines of T1 generation of transgenic papaya with the replicase mutant gene from papaya ringspot virus (PRV).The transgenic plants showed highly resistant or immune against PRV.Results indicated that the transgenes inherited to and expressed at RNA level in the progenies.