真核表达质粒pcDNA3.1-CSRP2-HA的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达。结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达。结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础。     

VEGF重组质粒pcDNA/V的构建及其在大鼠急性心肌缺血模型中的表达

构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)真核表达载体,并研究其在细胞水平和大鼠急性心肌梗死动物模型中的表达。利用RT-PCR方法,从人扁桃体组织中扩增人VEGF165基因,构建真核表达载体pcDNA/V。应用脂质体介导的基因转移技术,将pcDNA/V转染至人胚肾细胞(293细胞)中,经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆。ELISA、Westernblot检测证实重组质粒pcDNA/V能在293细胞中高效表达外源VEGF基因,鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验证实表达产物具有促血管生成的活性。进一步的体内表达研究,建立大鼠急性心肌梗死模型,将重组质粒pcDNA/V、空质粒pcDNA3.1( )分三点注射于梗死交界处心肌内,四周后取材。经免疫组化染色检测,pcDNA/V组在梗死交界区有VEGF阳性表达;电镜观察显示,pcDNA/V组在梗死交界处心肌细胞间有大量毛细血管内皮细胞增生。实验结果表明成功克隆了人VEGF165基因,构建了其真核表达载体。体内、外表达研究证实重组质粒的表达产物具有促血管生成的生物学活性,为VEGF基因治疗缺血性心肌病的研究提供实验基础。     

小鼠白细胞介素33真核表达质粒的构建及表达

克隆小鼠IL-33基因构建其真核表达质粒,并转染COS-7细胞检测其表达。提取C57BL/6小鼠肺组织总RNA,经反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-33基因,酶切后插入pcDNA^TM3.1/myc HisA构建其真核表达质粒pcDNA-3.1-IL-33,重组质粒转染COS-7细胞,RT-PCR和免疫印迹法（western blotting）检测目的基因表达。结果显示,pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列测定结果与小鼠IL-33cDNA序列一致,重组质粒转染COS-7细胞后检测到相应mRNA及蛋白表达。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

大鼠白介素10真核表达质粒在大鼠体内外肝细胞中的表达及影响

目的探讨体外重组的大鼠白介素10（rIL-10）真核表达质粒能否在大鼠体内外肝细胞中表达及表达产物对肝细胞的影响。方法通过受体介导的脂介体转染法及尾静脉大容量注射法将rIL-10真核表达质粒分别转入大鼠BRL细胞及体内大鼠肝细胞中,采用RT—PCR法、ELISA法和免疫组织化学法检测体内外肝细胞rIL-10的表达情况,MTT法及流式细胞术检测rIL-10真核表达质粒转染对BRL细胞增殖与凋亡的影响。结果转染rIL-10真核表达质粒的BRL细胞及大鼠肝组织高表达rlL-10基因,BRL细胞培养上清与大鼠血清中rIL-10浓度分别为（12．78±O．94）ng／ml,（61．68±3．60）．g／ml。MTT法及流式细胞术显示rIL-10的表达对肝细胞有-定的保护作用。结论rIL-10真核表达质粒可在大鼠体内外肝细胞中表达并对肝细胞有-定的保护作用。     

NMT在大肠杆菌中的His6融合表达及其纯化研究

将啤酒酵母ＮＭＴ基因以Ｎ端融合６个组氨酸的形式在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了ＩＰＴＧ诱导的表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析确定有与Ｈｉｓ。－ｒＮＭＴ理论分子量一致的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白的１０％左右;表达产物性质分析表明Ｈｉｓ－ｒＮＭＴ主要以可溶形式存在。在此基础上不受利用固定化金属离子配体亲和层析一步纯化目的蛋白,纯度可达９５％以上。体外标脾性是Ｈｉｓ６－ｒＮＭＴ具有与成熟ＮＭ     

通过同源重组构建酿酒酵母新型表达质粒

利用同源重组的方法, 构建了具有高拷贝数和高稳定性的新型酿酒酵母表达质粒. 对酵母附加体型载体pHC11进行一系列改造, 得到质粒pHC11R, 并用适当的酶切线性化; 利用PCR反应得到人IFNα2b表达单元片段, 它的两端和线性化的pHC11R的两端具有50 bp左右的同源区段. 上述两个片段共转化酿酒酵母, 在酵母体内经同源重组后得到表达质粒pHC11R-IFNα2b, 该表达质粒与 pHC11-IFNα2b相比去除了质粒上用于在大肠杆菌中复制和筛选所需的序列, 在宿主菌中的稳定性和拷贝数均有明显提高, 同时外源基因的表达量也获得了一定程度的提高. 在此基础上, 进一步构建了带有不同表达元件的pHR系列载体, 使得外源基因能够通过同源重组在酿酒酵母中快速、方便地克隆和表达.     

口蹄疫病毒多基因重组质粒在BHK-21细胞中的表达

利用定点突变的原理,获得包含有口蹄疫病毒P1,2A,3C及部分2B编码区的目的基因片段,KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,定向克隆于真核表达质粒载体pcDNA3.1（+）,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,将重组质粒pcDNA3.1/P12X3C转染BHK-21细胞,通过双抗体夹心ELISA方法和间接免疫荧光标记方法,检测细胞中表达的口蹄疫病毒抗原。结果表明,口蹄疫病毒基因片段正确克隆到真核表达质粒载体上,重组质粒pcDNA3.1/P12X3C可在BHK-21细胞中表达FMDV目的蛋白。     

HGF基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

目的:构建真核表达质粒p EGFP-N1-HGF并观察干细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人皮肤成纤维中的表达。方法:从扩增人的间充质干细胞中提取全长RNA为模板,设计合成引物,用RT-PCR法扩增出HGF基因片段,然后将HGF基因片段连接于真核表达质粒p EGFP-N1中。双酶切鉴定及测序分析后,用脂质体包裹转染体外培养的人的皮肤成纤维细胞,通过荧光显微镜观察其转染效果,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HGF蛋白的表达。结果:经酶切鉴定及测序验证p EGFP-N1-HGF构建正确,经转染的人皮肤纤维细胞中观察到较强的绿色荧光并且可以表达一定量的HGF。结论:成功构建了真核表达质粒p EGFP-N1-HGF,为基因治疗脱发疾病提供实验基础。     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

pcDNA3.1/CXCR7真核细胞表达载体的构建及其在内皮细胞中的表达鉴定

目的:CXCR7是基质衍生因子1(stroma derived factor-1,SDF-1)的新受体,且该受体在血管新生部位的内皮细胞中表达上调,故本研究拟构建CXCR7的真核表达载体pcDNA3.1/CXCR7,并检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达.方法:采用RT-PCR法从人肝癌细胞HepG2的cDNA中扩增出约1100 bp的CXCR7基因片段.采用KpnI、XbaI将目的基因和载体pcDNA3.1进行双酶切,将酶切产物加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜.将连接产物转化到感受态大肠杆菌中.挑取阳性克隆、提质粒,用双酶切、质粒DNA PCR扩增及DNA序列分析鉴定正确后,采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将其转染人脐静脉内皮细胞(HUwc),通过western-blot检测目的基因在内皮细胞中的表达.结果:阳性克隆经双酶切法鉴定含有CXCR7基因片段,质粒DNAPCR扩增出与CXCR7同等大小的基因片段,基因测序结果与GenBank中序列相同.转染HUVEC后,细胞中CXCR7的表达水平显著上升.结论:成功构建了CXCR7的真核表达栽体,可在内皮细胞中正常表达并.为进一步研究其作用机制奠定了基础.     

一种新型抗菌肽Cecropin B真核表达载体的构建

通过重叠区扩增法人工设计和合成一种新型抗菌肽Cecropin B基因,按正确的阅读框架定向克隆至巴斯德毕赤酵母的高效表达载体pPIC9K上。经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5ct菌落中含有插入Cecropin B基因的重组质粒pPIC9K—CB,表明成功构建了新型抗菌肽Cecropin B表达载体pPIC9K—CB。     

沙眼衣原体真核表达质粒pcDNA4/CT703的构建及其表达

目的：构建含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）基因CT703的真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,并检测其在HeLa细胞中的表达.方法：利用RT-PCR扩增CT703基因,然后将其亚克隆到真核表达载体pcDNA4,PCR、双酶切和测序检测重组质粒.将正确的重组质粒瞬时转染HeLa细胞,免疫荧光和Western Blot实验检测重组质粒目的蛋白表达. 结果：经PCR、双酶切和测序鉴定后,成功构建了真核重组表达质粒pcDNA4/CT703,将其转染HeLa细胞后,免疫荧光和Western Blot实验能检测到目的蛋白的表达.结论：成功构建了重组质粒pcDNA4/CT703,并能在HeLa细胞中表达,为进一步研究CT703的功能奠定了基础.     

小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7真核表达载体的构建及序列分析

利用PCR技术,从质粒pRSET／mIGFBP-7中获得目的基因小鼠胰岛素样生长因子结合蛋白-7（mIGFBP-7）,将其插入质粒pcDNA3．1／HisB中,构建了含mIGFBP-7的真核表达重组质粒pcDNA3．1／mIGFBP-7。经测序鉴定,重组质粒构建正确,为下一步对其功能研究奠定了基础。     

小鼠EVL 基因的克隆和真核表达载体的构建

目的:构建小鼠EVL(Ena/VASP like)基因的真核表达载体,为深入研究EVL的功能奠定基础.方法:采用PCR方法,从小鼠cDNA文库中,扩增出1245bp的EVL编码区片段,经电泳、胶回收后连接入pMD- 18T载体中,测序鉴定正确.用BamHI和HincⅡ双酶切,定向克隆EVL编码区片段到真核表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切鉴定重组质粒正确后.将重组质粒转染入HELA细胞中,以RT-PCR检测EVL的mRNA的表达,以Western Blot检测EVL蛋白的表达.结果:酶切鉴定结果显示小鼠EVL编码区基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1中;RT-PCR和Western Blot结果以及免疫荧光染色显示Hela细胞中有EVL的mRNA和蛋白的表达.结论:成功获得pcDNA3.1 -EVL的真核表达载体,为进一步深入研究EVL蛋白的功能奠定了基础.     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

Development of a Versatile Expression Plasmid Construction System for Aspergillus oryzae and Its Application to Visualization of Mitochondria

We report here a development of the MultiSite Gateway^TM-based versatile plasmid construction system applicable for the rapid and efficient preparation of Aspergillus oryzae expression plasmids. This system allows the simultaneous connection of the three DNA fragments inserted in entry clones along with a destination vector in a defined order and orientation. We prepared a variety of entry clones and destination vectors containing promoters, genes encoding carrier-proteins and fusion tags, and selectable markers, which makes it possible to generate 80 expression plasmids for each target protein. Using this system, plasmids for expression of the EGFP fused with the mitochondrial-targeting signal of citrate synthase (AoCit1) were generated. Tubular structures of mitochondria were visualized in the transformants expressing the AoCit1-EGFP fusion protein. This plasmid construction system allows us to prepare a large number of expression plasmids without laborious DNA manipulations, which would facilitate molecular biological studies on A. oryzae.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因真核表达质粒的构建和表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白真核表达质粒,并在HepG2细胞中稳定表达.方法:采用RT-RCR方法从丙型肝炎患者血清中得到HCVC区的cDNA序列,然后克隆入pcDNA3.0载体,构建真核表达质粒pcDNA-HCV,并进行酶切鉴定和测序鉴定;采用脂质体转染技术将pcDNA-HCV稳定转染于HepG2细胞系,并用G-418进行筛选;采用Western Blotting方法和免疫细胞化学方法检测HepG2细胞中HCV核心蛋白表达情况.结果:从HCV感染者血清中扩增得到的503bpHCV cDNA序列.属于HCV 1型基因C区,并成功构建了真核表达质粒pcDNA-HCV.经Western blotting和免疫细胞化学检测,稳定转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白的表达.结论:成功构建HCV核心蛋白真核表达质粒pcDNA-HCV,并可以在真核细胞HepG2中稳定表达.