电子显微镜超薄切片常规技术

本文将简要介绍国内电子显微镜(简称电镜)超薄切片的常规技术,供初学者便于了解和使用这种技术。表1介绍了人的眼睛借助仪器可以观察的范围。在电镜日常工作中,如何提高电镜的分辨率使之达到预期的目的,标本制备工作是十分重要的环节。也是电镜工作中最繁重、最艰巨的工作。这方面国内外均有专著出版。现结合前人的经验和国内一些实验室常用的方法和操作规程加以介绍。     

去包埋剂制片术揭示小麦珠被组织中微丝的跨胞分布

以ＤＧＤ包埋,去包埋剂制片法,结合常规电镜制备术,观察研究了小麦珠被组织中胞产连丝的结构与分布特征及其与微丝的关系。试验结果表明,同层珠被细胞间壁上胞间连丝的分布密度比上下层珠被间的要显著地高得多;珠被中是连丝保持因有的正常结构,孔径３０－４０ｎｍ,变动幅度不大,观察不到如作者以前２在小麦珠心和所见的那种甩镜连丝经结构个性而扩大,转变为开放态的景观。以去包埋剂制的进一步揭示,从胞南骨架网络表层有纤     

电镜酶细胞化学样品微波制备技术

在电镜酶细胞化学技术中，我们在样品的固定，温育，包埋剂浸渍和聚合等主要过程中均使用微波照射，不仅缩短了制样时间，而且由于使用了小标本，间歇微波照射，低温水浴及适当延长样品在固定液中的时间等改进技术，使细胞超微结构和酶的活性都得以更好保存。酶染色清无扩散，定位准确。     

Lowicryl K4M 低温包埋显示甲状腺球蛋白的免疫电镜法

免疫电镜集电子显微技术与免疫细胞化学技术于一体 ,能显示抗原或抗体在细胞微细结构水平的定位 ,已成为当今生物医学领域的一项重要研究手段。目前透射电镜观察的样本制备中 ,为保存良好超微结构的需要一般采用戊二醛、锇酸两种固定液 ;为使超薄切片有一定硬度采用的包埋剂如环氧树脂 6 18、 812需高温聚合 ,这些实验条件均可使多种抗原活性减低或丧失。因此 ,探索既能保持超微结构又能保存抗原性的电镜包埋剂及其应用很有必要。已知ＬｏｗｉｃｒｙｌＫ4Ｍ等低温包埋剂系列可能符合以上要求 ,为此我们进行了有关实验。材料和方法1.材料1 1…     

环氧树脂618和Epon812引起鼠伤寒沙门氏菌株细胞突变的超微结构研究

电镜实验室常用包埋剂环氧树脂618和Epon 812经Ames检测试验,表明两者均为直接致突变剂,它们的致突变性是同一数量级。超微结构观察提示,回变株细胞核区结构发生变异可能是受试环氧树脂烷化作用的结果。对于致突变试验阳性的电镜包埋剂应视为潜在的致癌剂而加以防范。     

去包埋剂制片术揭示小麦珠被组织中微丝的跨胞分布

以DGD(diethylene glycol distearate)包埋、去包埋剂制片法,结合常规电镜制备术,观察研究了小麦珠被组织中胞间连丝的结构与分布特征及其与微丝的关系。试验结果表明,同层珠被细胞间壁上胞间连丝的分布密度比上下层珠被间的要显著地高得多;珠被中胞间连丝保持固有的正常结构,孔径30—40 nm,变动幅度不大,观察不到如作者以前在小麦珠心和胚乳中所见的那种胞间连丝经结构修饰而扩大、转变为开放态的景象。对去包埋剂制片的观察进一步揭示,从胞质骨架网络表层有纤细微丝以分散状向外伸展突入分界壁,时而可见各个微丝横贯分界壁而连接相邻骨架网络的图象。联系珠被中正常胞间连丝结构的稳定性与各个微丝以分散状跨越分界壁,讨论了微丝参与胞间连丝结构的可能性与可能模式。     

北京鸭B淋巴细胞的中间纤维—核纤层—核内骨架体系

以北京鸭腔上囊为实验材料,应用细胞分级抽提方法与非树脂包埋－去包埋剂的电镜制样技术相结合,显示出Ｂ细胞中相互连结的中间纤维－核纤层－核内骨架体系的超结构及其分布,中间纤维交织成网络状,纤维直径在９－１１ｎｍ,其成份是分子量为６７ｋＤ,等电点约为６．２的波形蛋白,核纤民支呈片层状结构环绕在核区周围,其主要成份是分子量为６７ｋＤ,等电点偏酸性的Ｌａｍｉｎ Ｂ。核内骨架由粗细不一的纤维形成网络结构,其上     

寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)细胞核骨架与中间纤维的研究

甲藻(涡鞭毛虫,dinoflagellate)的细胞核是现存真核生物中最原始的。我们采用整装细胞制样和非树脂包埋去包埋剂超薄切片电镜技术,结合选择性生化抽提方法显示在寇氏隐甲藻(Cryptheccdinium cohnii)细胞中存在一个以水不溶性纤维蛋白成份为主的,贯穿于细胞核和细胞质的纤维网架系统,即核骨架-中间纤维结构体系,而Lamina结构不明显。免疫印迹法显示,甲藻细胞中存在类角蛋白组分,分子量为63kD和67kD,哺乳动物Lamin抗体与甲藻细胞全蛋白反应阴性。实验结果表明,在原始真核细胞中已经出现了类似于哺乳动物细胞的核骨架和中间纤维,并提示核骨架-中间纤维细胞骨架体系可能起源于真核细胞起源早期。本文对Lamina与中间纤维在进化上的关系及Lamina在真核细胞进化中的功能意义作了讨论。     

中枢神经系统损害：胶质细胞变化的电镜观察

电子显微镜(简称电镜)在医学和生物学上的应用,是近年值得注意的一个发展方向。通过电镜可以看清比光学显微镜精细得多的结构,一台分辨率为1—2埃的电镜,不仅能看清     

STORM和STED显微成像技术特点的比较

随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)技术和受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)显微镜技术是近年来发展迅速的两种超分辨率荧光显微镜技术。这两种技术均提供超越传统荧光显微镜分辨率成像的功能,具有多色显像,三维成像以及活细胞内成像的潜力。在这篇综述中,我们关注两种技术荧光控制、激光强度等技术参数设定,同时结合样品制备、图像采集与处理等流程优化对比两者在分辨率、图像采集时间及具体应用中的优劣。STORM可获得更高的三维分辨率,但可能需要更长的图像采集时间。STED需要较高损耗光强度,却能在图像采集后立即生成超分辨率图像,不需要额外图像数据处理。最终,选择STORM和STED不仅取决于技术的具体应用,还取决于操作者优化各环节技术参数的能力,从而决定图像质量。     

保持培养细胞原位、原形的超薄切片制备法

本文介绍先用环氧树脂Epon812包埋剂制成丘状膜,再在膜上培养细胞,直接将膜与细胞一起包埋,制备超薄切片。此种方法不仅能克服以往培养细胞需要离心成团,容易造成细胞破碎、变形的缺点;还能避免琼脂预包埋法悬浮细胞造成的抗原封闭;并能得到为数较多的连续超薄切片。它操作简便,较好地保持了培养细胞生长的原来位置及原有形状,为培养细胞进行免疫电镜的操作和提高制备培养细胞超薄切片的数量和质量提供了一种有效的途径。     

褐斑大蠊精母细胞联会复合体研究

采用表面铺展法结合银染技术制备联会复合体标本,在光镜、电镜下进行观察。发现褐斑大蠊精母细胞联会复合体(SC)的结构及演变符合一般规律;SC的相对长度与有丝分裂染色体的相对长度之间存在着良好的吻合性;电镜下可观察到SC侧线本身的双股结构;分类描述了核内的几种颗粒,并对相关的一些问题进行了讨论。     

植物叶片扫描电镜样品制备

本文介绍一种对植物叶片冷冻断裂,冷冻干燥的简易方法。即不使用任何包埋剂,仅在略加改装的真空镀膜仪中进行,便可制成能清晰地观察到叶片断面中各种组织和细胞的扫描电镜样品。此法操作简便,制样效果良好,可将扫描电镜技术从植物表面形态观察扩展到植物内部形态结构的研究。     

利用蜡叶标本进行子囊超薄切片的方法

利用蜡叶标本为材料,对地衣型子囊菌石耳科子囊进行超薄切片实验。由于对蜡叶标本的充分活化与包埋是该方法的关键,因此,在活化剂和包埋剂等方面进行了选择和调整,从而使超薄切片获得了良好的效果。     

褐斑大蠊精母细胞联会复合体研究

采用表面铺展法结合银染技术制备联会复合体标本,再光镜、电镜下进行观察。发现褐斑大蠊精母细胞连会复合体(SC)的结构及演变符合一般规律;SC的相对长度与有丝分裂染色体的相对长度之间存在着良好的吻合性;电镜下可观察到SC侧线本身的双股结构;分类描述了核内的几种颗粒并对相关的一些问题进行了讨论。     

生物三维电子显微学进入全新高速发展时期

生物三维电子显微学主要由三个部分组成——电子晶体学、单颗粒技术和电子断层成像术,其结构解析对象的尺度范围介于x射线晶体学与光学显微镜之间,适合从蛋白质分子结构到细胞和组织结构的解析。以冷冻电镜技术与三维重构技术为基础的低温电子显微学代表了生物电子显微学的前沿。低温单颗粒技术对于高度对称的病毒颗粒的解析最近已达到3．8A分辨率,正在成为解析分子量很大的蛋白质复合体高分辨结构的有效技术手段。低温电子断层成像技术目前对于真核细胞样品的结构解析已达到约40A的分辨率,在今后5年有望达到20A。这样,把x射线晶体学、NMR以及电镜三维重构获得的蛋白质分子及复合体的高分辨率的结构,锚定到较低分辨率的电子断层成像图像中,从而在细胞水平上获得高精确的蛋白质空间定位和原子分辨率的蛋白质相互作用的结构信息。这将成为把分子水平的结构研究与细胞水平的生命活动衔接起来的可行途径。     

最原始的真核生物——源真核生物的核骨架

利用选择性抽提 ,结合DGD包埋 去包埋剂和整装制样两种电镜技术以及Westernblot技术 ,对现存最原始的真核生物———源真核生物 (Archezoa)的核骨架进行了研究 .结果显示此类生物已具有了核骨架结构 ,其胞质中也具有了发达的中间纤维 ,且像高等真核细胞一样 ,此两者的纤维互相联系成一个统一的结构体系 ;但不具核仁骨架 ,其核纤层不典型或不发达 ,且只由一种相当于高等真核细胞核纤层B型成分所组成 .据以上并结合其他研究结果 ,认为随着“真核型”染色质的起源形成 ,核骨架在真核细胞起源进化的极早时期也已起源 ,且此两者的共同起源应是原核进化成真核的重要前提条件 ;核纤层蛋白 (基因 )家族的进化应是最先起源形成B型(基因 ) ,在此基础上再分化出A型 (基因 ) .     

研发动态

<正>清华大学解析出基因剪接的基础结构清华大学生命科学学院施一公研究组近日得到近原子分辨率的剪接体三维结构和剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理,从而将分子生物学"中心法则"在分子机理的研究上大幅度向前推进。成果以两篇背靠背研究论文形式发表在《科学》杂志。第一篇文章题为《3.6埃的酵母剪接体结构》,报道了通过单颗粒冷冻电子显微镜(冷冻电镜)方法解析的酵母细胞剪接体近原子水平分辨率的三维     

免疫电镜法

免疫电镜法是把免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来,研究抗原抗体相互作用的一种技术方法。随着电镜分辨率的提高和电镜对组织细胞及微生物超微结构研究的发展,为从超微结构水平或分子水平上研究免疫作用,提供了良好条件。现将最广泛应用的铁蛋白抗体法和酶抗体法简介如下。 (一)铁蛋白抗体法 铁蛋白性质随动物种类不同而有所不同,最常用的是马脾铁蛋白,在电镜下可见直径约100的蛋白壳,壳内有直径为55的铁核心。使用市售铁蛋白前要经过提纯。     

小麦胚乳细胞内,细胞间胞质骨架分布格局的超微结构观察

以小麦（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）幼嫩胚乳为材料,经ＴｒｉｔｏｎＸ１００抽提、ＤＧＤ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｄｉｓｔｅａｒａｔｅ）渗透、包埋,制备去包埋剂超薄切片,对细胞内、细胞间胞质骨架的分布格局与特征进行了电镜观察。由所获图像可见,胞质骨架呈主要由微管、微丝组成的三维网络结构;特别值得注意的是,有不少５～７ｎｍ的微丝在多处从网络表层向胞壁界面方向突出,并时而可见其横贯分界壁连接相邻骨架网络而将相邻细胞骨架联成一体。胚乳组织中微丝的跨胞分布以两种形式存在,直径达１００～２００ｎｍ微丝束的跨越和单个微丝的分散贯穿,看来这与该组织中开放态胞间通道与正常胞间连丝同时并存相吻合。初步讨论了微丝参与正常胞间连丝结构的可能性。