α7nAChR调控STAT3磷酸化在星形胶质细胞机械性损伤后炎症反应中的作用

目的:通过建立星形胶质细胞机械性损伤模型,研究烟碱型乙酰胆碱受体α7亚单位(α7nAChR)在创伤性脑损伤后星形胶质细胞炎症反应中的作用及调控机制。方法:建立星形胶质细胞机械性损伤模型,通过ELISA检测炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的表达;利用α7n ACh R抑制剂α-BGT和激动剂PHA-543613处理星形胶质细胞,检测相关炎症因子表达,并通过Western blot检测信号传导及转录活化因子3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达;利用α-BGT和STAT3抑制剂Stattic处理星形胶质细胞,检测相关炎症因子表达。结果:①星形胶质细胞机械性损伤后,促炎因子IL-1β、TNF-α表达增加,抗炎因子IL-10、TGF-β表达降低(P0.05)。②利用α-BGT抑制α7nAChR可增加损伤后IL-1β、TNF-α的表达,减少IL-10、TGF-β的表达(P0.05);而利用PHA-543613激活α7nAChR功能,则发挥相反作用(P0.05)。③α-BGT可促进STAT3磷酸化,而PHA-543613抑制STAT3磷酸化(P0.05)。④STAT3抑制剂Stattic可减少IL-1β和TNF-α的表达,增加IL-10和TGF-β的表达,并部分阻断α-BGT对IL-1β、TNF-α、IL-10及TGF-β表达的影响(P0.05)。结论:机械性损伤后,激活α7nAChR可减轻星形胶质细胞炎症反应,而抑制STAT3磷酸化是其重要的下游机制。     

烟草诱导的M2型巨噬细胞对肺癌细胞侵袭转移的影响

为探究烟草提取物(cigarette smoke extract, CSE)对单核细胞THP-1的趋化作用及CSE活化后的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)对非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC) A549和PC-9细胞侵袭迁移的影响,该文用CSE处理THP-1细胞96 h后, ELISA检测TGF-β、TNF-α、IL-10、IL-12的蛋白表达水平, qRT-PCR检测TGF-β、TNF-α、IL-10、IL-12的mRNA表达水平,流式细胞术检测CD163+的表达水平, Western blot检测p-STAT6/STAT6的蛋白表达水平。CSE活化的TAMs与NSCLC细胞共培养, Western blot检测TAMs对NSCLC细胞EMT(Ecadherin和Vimentin)的影响; Transwell检测TAMs对NSCLC细胞侵袭迁移的影响。结果显示, CSE诱导THP-1细胞的表型向M2型TAMs方向分化(TGF-β、CD163+上升, TNF-α、IL-12下降, P0.05)。pSTAT6/STAT6通路参与CSE诱导THP-1细胞的M2型转化。CSE诱导的TAMs促进NSCLC细胞发生EMT(E-cadherin下降和Vimentin上升),进而促进其侵袭迁移(P0.05)。以上结果表明, CSE通过pSTAT6/STAT6诱导THP-1发生M2型TAMs的活化,活化后的TAMs促进NSCLC细胞发生EMT和侵袭迁移。     

Treg细胞在慢性乙肝患者外周血中的表达及其对DC细胞的抑制作用

目的:检测慢性乙型肝炎患者外周血中Treg细胞的比例,探讨其对DC细胞的免疫抑制作用。方法:检测CHB患者和正常对照组外周血CD4+,CD25+,Treg及DC表面因子CD80和HLA-DR的表达;在DC培养不同时间内加入不同比例CHB Treg细胞,观察DC对淋巴细胞增殖的影响以及细胞因子IL-10及TGF-β的表达变化。结果:CHB患者外周血Treg细胞比例高于对照组,差异有统计学意义(P0.05);CHB患者DC细胞表面分子CD80和HLA-DR表达均低于对照组,差异有统计学意义(P0.05);经Treg细胞处理后,DC细胞刺激淋巴细胞的增殖能力下降,淋巴细胞增殖的抑制率显著升高(P0.05);随Treg细胞增加,IL-10及TGF-β水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:CHB患者外周血中Treg细胞的增加可能通过诱导IL-10和TGF-β的表达来抑制DC细胞的免疫功能。     

lncRNA BANCR 在晶体上皮细胞上皮-间质转化，增殖、凋亡及自噬的作用

目的:探索长链非编码RNA BANCR(lncRNA BANCR)在人晶状体上皮细胞FHL24中对上皮-间质转化的作用,并进一步探究了其调控晶体上皮细胞增殖、凋亡及自噬的作用及相关分子机制。方法:运用qReal-time PCR检测TGF-β诱导对FHL24细胞内EMT相关标志物α-SMA,E-cadherin,Coll I,ZO1及BANCR m RNA相对表达量。细胞中转染BANCR。Western印迹检测各组细胞中EMT相关标志蛋白及LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达。MTT法检测各组细胞的增殖,凋亡情况。结果:与正常对照组比较,TGF-β诱导组细胞中BANCR,α-SMA, Coll I,ZO1 m RNA的相对表达量明显增加,而E-cadherin m RNA显著下降,差异均有统计学意义(t=-5.031,-7.145,-9.023,-6.012, 5.097均P0.05),以上因子的蛋白表达趋势相同,差异均有统计学意义(均P0.05)。si RNA-BANCR TGF-β诱导组细胞中E-cadherin m RNA相对表达量比si RNA TGF-β诱导组显著增加(t=-9.98, P0.05);α-SMA,Coll I及ZO1 m RNA相对表则显著减少(t=9.003; 27.738; 19.620, P0.05)。抑制BANCR后细胞增殖活力48、72 h时细胞活性显著降低(t=5.032, 9.041,均P0.05),细胞凋亡率显著升(t=16.772,P0.001)。自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I比例增加(P 0.05)。结论:长链非编码BANCR参与了晶体上皮细胞的抑制其上皮-间质转化,抑制BANCR可抑制晶体上皮细胞增殖、增加凋亡及自噬的发生。     

血管细胞黏附分子-1对卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨过表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:构建过表达VCAM-1的慢病毒载体GV358-VCAM1+,转染人类卵巢癌IGROV1细胞株,利用嘌呤霉素筛选稳定表达VCAM-1的IGROV1细胞,通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,确定细胞转染效率,Western blot及RT-PCR法确定卵巢癌细胞VCAM-1蛋白和m RNA水平;采用流式细胞仪检测过表达VCAM-1的IGROV1的细胞凋亡变化,western blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3)以及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的变化。结果:成功构建的慢病毒载体GV358-VCAM1+在IGROV1细胞中的转染效率达到85%以上,转染细胞的VCAM-1蛋白及m RNA水平均呈稳定表达;VCAM-1过表达卵巢癌细胞的细胞凋亡显著高于空载体对照组(P=0.0149);Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3表达水平均较对照组显著升高(P0.01),Bcl-2、p-STAT3表达水平明显低于对照组(P0.01),但STAT3表达水平无显著改变。结论:VCAM-1可能通过下调STAT3的磷酸化水平诱导卵巢癌细胞凋亡。     

X射线对A549细胞DNA的损伤可能与JAK/STAT信号通路的激活有关

本研究旨在观察不同剂量X射线对A549细胞DNA的损伤和JAK/STAT信号通路激活水平之间的关系。分别用2、4、8Gy X射线对A549细胞进行照射后,用CCK8法检测A549细胞增殖情况,用酶联免疫法检测照射后不同时间点培养液上清中白介素6 (interleukin 6, IL-6)的含量,用免疫荧光染色法检测细胞IL-6受体(IL-6 receptor, IL-6R)和p53结合蛋白1 (p53 binding protein 1, 53BP1)的蛋白表达情况,用Western blot检测细胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白表达水平。结果显示,和对照组相比,X射线照射可降低细胞增殖水平,上调53BP1表达,提高细胞培养液上清中IL-6含量,并上调IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3表达水平。X射线照射的上述作用存在一定的剂量依赖性。以上结果提示,X射线造成细胞DNA损伤的机制可能与JAK/STAT信号通路的激活有关。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1疫苗毒及其N蛋白对山羊PBMCs免疫效应的影响

小反刍兽疫(PPR)是羊、骆驼等小反刍动物的一种急性、烈性、接触性A类传染病,发病率和致死率极高.目前,PPR在全球仍呈现区域性流行和多地散发势态.为探讨PPRV及N蛋白体外诱导山羊外周血单个核细胞(PBMCs)在不同时间对PBMCs免疫应答效应的影响.本研究将PPRVNigeria75/1疫苗毒(1 MOI)、重组N蛋白(10μg/mL)和RPMI 1640(阴性对照)体外刺激PBMCs 48h、72h、96h.采用CCK-8法检测PBMCs细胞增殖情况;qRT-PCR及ELISA检测炎症因子包括IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-a和IFN-γ的mRNA表达水平及分泌情况;流式细胞术检测T细胞CD4+和CD8+的表达、及单核来源树突状细胞(DCs)表面分子CD40、CD86、CD80的表达、以及检测PPRV感染PBMCs引起的细胞凋亡.研究发现:与对照组相比,PPRV能够抑制PBMCs的体外增殖,显著促进炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的表达(P＜0.05).并且PPRV感染PBMCs产生细胞凋亡,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞表达.另外PPRV体外刺激DCs,CD40、CD86、CD80的表达显著升高(P＜0.05),提示PPRV具有刺激DCs细胞成熟与分化的功能.进一步研究发现PPRV N蛋白体外刺激PBMCs能引起与PPRV作用相同的免疫效应.本研究表明PPRV Nigeria75/1疫苗毒体外感染PBMCs主要引起炎症反应与细胞凋亡、促进单核来源DCs成熟与分化,并且N蛋白参与PPRV引起的各项免疫功能.     

调节性T 细胞在发热结缔组织病患者外周血中的表达及临床意义

目的:研究Treg细胞在发热CTD患者外周血表达对结核感染的诊断价值。方法:对103例发热CTD患者进行T-SPOT.TB试验,将39例阳性者设为实验组-1,进行抗结核治疗,将64例阳性者设为实验组-2,另选取40例健康者作为对照组,检测三组外周血CD4+CD25+Treg细胞、Foxp3基因、IL-10、TGF-β的表达。结果:实验组CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞占CD4+T比例高于对照组(P0.05),实验组-1治疗前外周血CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞占CD4+T比例高于实验组-1治疗后、实验组-2(P0.05);实验组TGF-β表达量低于对照组(P0.05),实验组-1治疗前低于实验组-1治疗后及实验组-2(P0.05);实验组-1治疗前IL-10表达量低于实验组-1治疗后、实验组-2及对照组(P0.05)。结论:CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞在发热CTD伴有结核感染患者外周血中的表达升高,其变化可作为结核感染诊断的辅助性指标。     

胰岛素生长因子-1(IGF-1)通过PI3K/Akt通路抑制骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡

该研究通过构建高表达胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的异常微环境模型探讨IGF-1对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)凋亡的影响及可能的作用机制,为BMSCs作为载体在靶向治疗肿瘤过程中的安全应用提供前期实验基础。取分离纯化的大鼠BMSCs,用流式细胞术鉴定BMSCs表面标志,将实验分为4组:BMSCs空白对照组、IGF-1刺激组、IGF-1+LY294002阻断剂组和IGF-1+MK2206阻断剂组。加药处理2周后,CCK-8法检测细胞增殖能力;Hoechst 33342染色观察细胞核形态及凋亡比例;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞线粒体膜电位变化;RT-qPCR检测细胞Akt、Bad、Bcl-xl、c-Myc、STAT3的m RNA水平;Western blot检测细胞Akt、p-Akt、Bad、p-Bad、Bcl-xl、c-Myc、STAT3、p-STAT3的蛋白水平。结果显示:IGF-1刺激组细胞与BMSCs空白对照组比较增殖率升高,凋亡率减低;IGF-1刺激组Bad、Bcl-xl、cMyc、STAT3的mRNA的表达均显著高于BMSCs空白对照组(P0.05);IGF-1刺激组p-Akt、Bad、p-Bad、Bcl-xl、c-Myc、STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平显著高于BMSCs空白对照组(P0.05)。而阻断剂组细胞(IGF-1+LY294002阻断剂组、IGF-1+MK2206阻断剂组)与IGF-1刺激组比较增殖率均降低,凋亡率增高,相关分子m RNA和蛋白表达水平均明显降低。以上结果表明,IGF-1能通过活化PI3K/Akt通路,激活下游增殖和凋亡相关分子,从而促进BMSCs增殖,抑制BMSCs凋亡。     

槲皮素对骨髓间充质干细胞移植联合肾移植所诱导的免疫耐受的影响

目的探讨槲皮素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导肾移植免疫耐受的影响。方法在对肾移植后的大鼠给予BMSCs治疗的基础上,同时给予不同剂量的槲皮素,观察其诱导免疫耐受的效果。建立大鼠肾移植模型,随机分为4组:对照组、BMSC组、MSC+高/低剂量槲皮素干预组。Western blot检测各组肾组织中Janus激活激酶(JAK)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)、p-STAT3的蛋白表达水平,ELISA检测血清中转化生长因子β1(TGF-β1)水平。收集BMSC组肾小管上皮细胞,干扰及过表达STAT3的同时予以槲皮素干预,使用Western blot检测JAK、STAT3、p-STAT3及TGF-β1表达。采用单因素方差分析比较各组间数据差异,组间数据两两比较采用SNK-q检验。结果大鼠经肾移植后,对照组血清中TGF-β1蛋白表达(19162±223)pg/ml高于其他组,BMSC组(12 106±163)pg/ml、MSC+高槲皮素干预组(9 113±110)pg/ml、MSC+低槲皮素干预组(9 024±133)pg/ml。3组分别与对照组比较P均0.01。对照组肾组织中JAK、p-STAT3的蛋白相对表达量(1.5±0.2,10.7±0.5)均高于其他各组[MSC组(0.9±0.3,8.5±0.2;P均0.01)、MSC+高槲皮素干预组(0.7±0.2,6.1±0.3;P均0.01)、MSC+低槲皮素干预组(0.7±0.3,5.8±0.1;P均0.01)]。干扰STAT3后肾小管上皮细胞中p-STAT3和TGF-β1蛋白相对表达量(0.7±0.1,0.3±0.1)均少于其他各组[对照组(8.2±0.4,7.1±0.5;P均0.01)、槲皮素干预组(5.6±0.3,4.8±0.4;P均0.01)、空白对照组(5.7±0.3,4.5±0.4;P均0.01)]。过表达STAT3后中p-STAT3和TGF-β1蛋白相对表达量(10.5±0.6,8.4±0.5)高于槲皮素干预组[(5.7±0.3,5.4±0.3);P均0.01]和空白对照组[(6.1±0.1,5.6±0.4);P均0.01]。结论大鼠肾移植时在给予BMSCs注射的同时给予槲皮素干预,可有效地抑制免疫排斥反应,改善肾功能;JAK/STAT3/TGF-β1可能参与了槲皮素诱导的免疫调节。     

IL-17对人脐带间充质干细胞体外免疫调节特性的影响

目的:研究白细胞介素17(IL-17)对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的免疫调节能力的影响。方法:采用组织块贴壁法从健康足月胎儿脐带中分离培养hUC-MSCs,并对其进行鉴定。然后在培养基中加入不同浓度IL-17,采用EdU细胞增殖法检测hUC-MSCs增殖情况,流式细胞术(FCM)检测h UC-MSCs表面标记及细胞周期,RT-qPCR检测免疫调节相关基因表达水平,ELISA检测上清中免疫调节相关因子分泌水平,免疫学反应检测其免疫调节能力。结果:①倒置显微镜下观察可见hUC-MSCs呈现较均一漩涡状、梭形生长,细胞体积较小;细胞表面表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD19、CD11b、CD45、HLA-DR;具有成脂、成骨、成软骨诱导分化能力。②FCM检测结果显示IL-17处理后,hUC-MSCs免疫表型未发生变化,而IFN-γ处理后,hUC-MSCs表面标记HLA-DR表达明显上调。③与对照组相比,IL-17处理组的hUC-MSCs活性更好,且能促进细胞增殖。④与空白对照组相比,IL-17处理组h UC-MSCs的TGF-β、IL-10、IDO、PGE2、TSG-6、PD-L1基因表达均显著上调(P<0.001)。⑤ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,IL-17处理组上清中TGF-β、IL-10、IDO、PGE-2、TSG-6、PD-L1分泌水平明显增高(P<0.001)。⑥与空白对照组相比,IL-17处理组的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞的比例降低,Treg细胞比例增高(P<0.001)。结论:IL-17在不影响hUC-MSCs免疫表型的条件下,可促进细胞增殖,上调免疫相关基因表达,提高TGF-β、IL-10、PGE-2、IDO、TSG-6、PD-L1分泌水平,增强hUC-MSC免疫调节能力。因此,本研究将为预处理的hUC-MSCs防治免疫炎症性疾病提供理论依据。     

Toll样受体4结合脂多糖对天然调节性T细胞抑制功能的影响及其机制

探讨Toll样受体4结合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对天然调节性T细胞(natural regulatory T cells,n Tregs)抑制功能的影响及其机制。采用磁珠分选健康人外周血中n Tregs,并用流式细胞术检测分选纯度后进行原代细胞培养。将不同浓度的LPS(10μg/m L,1μg/m L,0.1μg/m L)分别加入抗TLR4单抗封闭的n Tregs(即anti-TLR4+LPS组)和正常n Tregs(即Non anti-TLR4组)两组细胞、同时设定不加LPS作为对照组。采用实时定量PCR和酶联免疫吸附(ELISA)检测各组n Tregs中IL-10、TGF-β的m RNA表达水平和细胞培养上清液中蛋白含量。采用CFSE法流式细胞术检测不同浓度LPS处理的n Tregs与CD4+T效应细胞混合培养后CD4+T细胞的增殖水平。Western blotting检测LPS刺激后n Tregs的胞浆及胞核中NF-κBP65蛋白表达水平。结果分选得到的n Tregs纯度82%(84.52±2.10)%。Non anti-TLR4组n Treg细胞中IL-10的m RNA表达水平和培养上清液中蛋白含量均较对照组和anti-TLR4组显著增加(p0.05),且anti-TLR4组n Treg细胞IL-10的m RNA和培养上清液蛋白含量均较对照组显著降低(p0.05);Non anti-TLR4组n Treg细胞中TGF-β的的m RNA表达水平和培养上清液中蛋白含量均较对照组和anti-TLR4组均显著降低(p0.05),且anti-TLR4组n Treg细胞中TGF-β的m RNA表达水平和培养上清液中蛋白含量较对照组显著增高(p0.05)。n Tregs可显著抑制CD4+T细胞的增殖,且与CD3/CD28抗体活化的阳性对照组相比有差异(p0.05)。Non anti-TLR4组中,CD4+T细胞增殖指数较对照组显著降低(p0.05);anti-TLR4组中,CD4+T细胞增殖指数较阴性对照组显著增加(p0.05),较阳性对照组亦明显增加(p0.05)。1μg/m L LPS刺激后,Non anti-TLR4组n Tregs胞浆蛋白中NF-κBp65的含量较对照组降低,而胞核中则相应增加;anti-TLR4组则无明显变化。因此本研究认为,n Tregs膜型TLR4与LPS相互结合,可促使n Tregs抑炎性因子(IL-10,TGF-β)m RNA表达水平和分泌含量产生变化,可增强对效应性CD4+T细胞增殖的抑制功能,其变化机制可能与NF-κB信号分子活化相关。     

重楼皂甙Ⅱ对狼疮性肾炎患者外周血CD4+CD25+T调节细胞表达的细胞因子的影响

目的:研究重楼皂甙Ⅱ对狼疮性肾炎患者外周血CD4+CD25+Treg分泌的细胞因子IL-10和TGF-β的影响。方法:10例健康人为正常对照组,20例LN病人随机分为四组:LN对照组(n=5)、重楼干预组1(n=5,接种细胞数为1×105/1.5ml/孔)、重楼干预组2(n=5,接种细胞数为2×105/1.5ml/孔)、重楼干预组3(n=5,接种细胞数为5×105/1.5ml/孔)。分离外周血单个核细胞,利用免疫磁珠法分离CD4+CD25+Treg。重楼干预组予重楼皂甙Ⅱ干预,正常对照组和LN对照组不予处理,各组培养72h。取各组上清,用ELISA分别检测IL-10和TGF-β的水平。结果:与正常组比较,其余各组TGF-β和IL-10的水平明显降低(P<0.01)。与LN对照组比较,重楼皂甙Ⅱ干预后各组TGF-β和IL-10的水平升高(P<0.05)。重楼干预组之间比较,重楼干预组2的TGF-β和IL-10水平较其他两组明显升高(P<0.01),而重楼干预组1和3的TGF-β和IL-10水平变化无显著性差异(P>0.05)。结论:重楼皂甙Ⅱ可上调LN患者TGF-β和IL-10的水平,上调的幅度受接种细胞数量的...     

变应性鼻炎患者外周血中Tr1/Th3细胞的检测和分析

目的:检测变应性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)患者和健康对照者外周血中IL-10+CD4+T细胞、TGF-β+CD4+T细胞(分别代表Tr1细胞和Th3细胞的特性)的比例,并探讨其在AR发病中的意义,为AR的治疗提供临床参考。方法:分离19例对粉尘螨过敏的AR患者和19例健康对照者外周血单个核细胞(PBMCs),采用流式细胞术分别检测外周血中IL-10+CD4+T细胞、TGF-β+CD4+T细胞的比例。结果:同健康对照者相比,AR患者外周血中IL-10+CD4+T细胞的比例显著降低[(1.66±0.48)%vs.(3.80.92)%,t=-9.08,P0.01)],AR患者外周血中TGF-β+CD4+T细胞的比例降低[(1.92±0.54)%vs.(4.76±1.12)%,t=-9.94,P0.01)]。结论:外周血中IL-10+CD4+T(Tr1)细胞比例的降低可能是AR发病的一个重要因素,提高AR患者外周血中分泌IL-10的Tr1细胞的比例可能在AR的治疗中具有重要意义。外周血中TGF-β1+CD4+T(Th3)细胞的比例显著降低,可能是AR发病的一个重要因素。但TGF-β1与AR关系的研究较少,特别是外周血中TGF-β1水平与AR的关系研究较少,需进一步研究。     

过表达miR-498通过下调STAT3抑制类风湿性关节炎患者Th17细胞分化

本文旨在探讨微小RNA-498(miR-498)影响类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Th17细胞分化的作用机制。从50例RA患者和50例对照人群中分别收集外周血,分离PBMCs。流式细胞术检测CD4~+IL-17~+T(Th17)细胞或者CD4~+FOXP3~+T(Treg)细胞比例,并分析Th17/Treg比值。Real-time PCR检测细胞中miR-498和STAT3基因表达,Western blot检测STAT3的蛋白表达,ELISA检测外周血血清或细胞上清中IL-17的浓度。荧光素酶报告基因实验验证miR-498靶向结合STAT3的3’非翻译(3’untranslated region,3’UTR)。miR-498 mimic或/和pc DNA-STAT3瞬时转染CD4~+T细胞,进一步考察miR-498影响Th17细胞分化的机制。结果显示,RA患者的PBMCs中,Th17细胞比例显著高于对照,且Th17/Treg比值也显著高于对照(P0.05)。miR-498低表达而STAT3高表达于RA患者的PBMCs中,且RA患者血清中的IL-17浓度显著高于对照(P0.05)。在转染野生型STAT3报告基因质粒的细胞中转染miR-498 mimic/inhibitor后,荧光酶活性、STAT3的基因和蛋白表达均明显改变(P0.05),但是在转染突变型STAT3报告基因质粒的细胞中转染miR-498 mimic/inhibitor,上述指标没有显著变化(P0.05)。此外,miR-498 mimic转染CD4~+T细胞后,显著降低Th17细胞比例,且细胞分泌IL-17的水平减少(P0.05),而与pcDNA-STAT3共转CD4~+T细胞后,Th17细胞比例明显提高,细胞分泌IL-17的水平增加(P0.05)。以上结果提示,在RA患者CD4~+T细胞中,过表达miR-498靶向下调STAT3,进而抑制Th17细胞分化。     

LncRNA MEG3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)人母系表达基因(Maternally expressed gene 3,MEG3)对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法:选取我院住院的OA患者和半月板损伤患者各40例,采用RT-PCR检测两组患者软骨组织和细胞中MEG3的表达。在OA软骨细胞中,转染si RNA-MEG3(si-MEG3)或过表达MEG3的慢病毒载体(LV-MEG3),采用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况,RT-PCR和western blot检测PCNA、Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达。结果:OA患者膝关节软骨组织中MEG3的表达水平明显低于半月板损伤患者软骨组织(P0.05),同时OA软骨细胞中MEG3的表达水平明显低于正常软骨细胞(P0.05)。OA软骨细胞转染siMEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显下降(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显升高(P0.05),S期细胞比例明显下降(P0.05),细胞凋亡率明显增加(P均0.05)。低表达MEG3能够显著降低Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),增加GSK-3βm RNA和蛋白表达水平(P均0.05)。在OA软骨细胞转染LV-MEG3后,细胞增殖能力和PCNA表达明显升高(P均0.05),G0/G1期细胞比例明显下降(P0.05),S期细胞比例明显增加(P0.05),细胞凋亡率明显减少(P均0.05)。高表达MEG3能够显著增加OA软骨细胞中Dvl2、GSK-3β、cyclinD1和β-catenin m RNA和蛋白表达水平(P均0.05),降低GSK-3βm RNA和蛋白表达(P均0.05)。同时,采用XAV939阻滞Wnt/β-catenin信号通路能够显著逆转过表达MEG3对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响。结论:MEG3在OA患者和软骨细胞中均显著低表达,并能够通过阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活影响OA软骨细胞增殖和凋亡。MEG3可能成为OA治疗的重要靶分子。     

骨髓间充质干细胞培养液促进STAT3磷酸化诱导Raw264.7细胞向M2型极化

炎症性疾病的发生是当今临床医学攻克的重点。M1型巨噬细胞分泌炎症因子产生炎症,而M2型巨噬细胞分泌抑炎因子抑制炎症的发生。M1型巨噬细胞向M2型极化,则是从炎症状态转变成抑制炎症发生的状态,因此研究巨噬细胞向缓解炎症的M2型极化将有利于炎症性疾病的治疗。本研究利用骨髓间充质干细胞(BMSC)培养液处理已被脂多糖(LPS)诱导呈M1型的Raw264.7巨噬细胞,探究骨髓间充质干细胞培养液(BMSC-CM)对巨噬细胞向M2型极化的影响及其分子机制。提取来源于3周龄C57BL/6鼠的骨髓间充质干细胞;再收集BMSC-CM处理M1型的Raw264.7巨噬细胞;半定量PCR检测M1型标记基因[肿瘤坏死因子α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(INOS)]和M2型标记基因[精氨酸酶1(ARG-1)和转化生长因子β1(TGF-β1)]mRNA表达以及白介素10(IL-10)mRNA表达水平;Western蛋白质印迹法检测信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)和磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达。本研究发现,经过BMSC-CM培养后的M1型的Raw264.7巨噬细胞,其M2型相关指标ARG-1和TGF-β1 mRNA水平明显上升,并且IL-10 mRNA水平和p-STAT3蛋白水平也明显上升。这些结果说明,骨髓间充质干细胞培养液通过IL-10/STAT3信号通路促进STAT3磷酸化,诱导巨噬细胞Raw264.7细胞向M2型极化。     

鸦胆子油乳注射液可能通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制胰腺癌AsPC-1细胞上皮–间质转化

该文旨在探讨鸦胆子油乳注射液(简称鸦胆子油乳)调节JAK2/STAT3信号通路对胰腺癌细胞上皮–间质转化(EMT)的影响。将胰腺癌AsPC-1细胞分为对照组、鸦胆子油乳低剂量组、鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、鸦胆子油乳高剂量+Colivelin(JAK2/STAT3激活剂)组。该研究采用细胞划痕实验检测细胞迁移; Transwell实验检测细胞侵袭; MTT、EdU检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率; qRT-PCR检测细胞JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达; Western blot检测细胞JAK2/STAT3通路、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平。结果显示,与对照组相比,鸦胆子油乳低、中、高剂量组细胞活力、增殖率、细胞划痕愈合率、侵袭细胞个数、JAK2mRNA、STAT3 mRNA、N-cadherin、Vimentin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平显著降低,细胞凋亡率和细胞E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)。与鸦胆子油乳高剂量组相比,鸦胆子油乳高剂量+Colive...     

在肝癌细胞SK-Hep1中沉默STAT3基因增强sorafenib疗效的初步研究

目的:研究STAT3在肝癌细胞SK-Hep1对sorafenib抗性中的作用,并探讨STAT3基因沉默在增强sorafenib肝癌疗效中的作用。方法:应用基于shRNA的基因沉默技术在肝癌细胞SKHep1中敲减STAT3;用CCK8法检测细胞的生长情况与对sorafenib的敏感性;蛋白印迹法(Western blot)检测STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)以及其下游蛋白的表达变化。结果:成功构建了STAT3敲减的细胞株SK-Hep1-sh STAT3。该细胞中STAT3蛋白表达降低,细胞增殖明显受到抑制。Sorafenib的处理下调了STAT3的磷酸化水平及其下游蛋白Mcl-1和Cyclin D1的表达。STAT3基因敲减的SK-Hep1细胞,对sorafenib的敏感性增强。结论:基于shRNA的STAT3基因沉默能明显抑制SK-Hep1细胞增殖,提高细胞对sorafenib的敏感性,有望成为提高sorafenib抗肝癌疗效的一种新手段。