可诱导型CRISPRi系统的构建及其初步应用

[目的]构建可诱导型CRISPRi系统以特异性地抑制靶基因的表达。[方法]采用PCR技术将人ZNF10基因的KRAB结构域编码序列分别克隆至d Cas9蛋白编码基因的5’端(KRAB-d Cas9)与3’端(d Cas9-KRAB)。设计并构建靶向荧光素酶报告基因起始密码子附近序列的4种gRNA表达载体,其表达受到含有Tet O调控元件的H1启动子调控。分析共表达d Cas9蛋白和gRNA对共转染的荧光素酶报告基因表达水平的影响。在此基础上,设计并构建靶向人KLHL21基因转录起始位点附近区域的3种gRNA表达载体,将其与KRAB-d Cas9融合表达载体分别共转染HEK293T细胞,24h后收集细胞并采用荧光实时定量PCR与蛋白质印迹技术分析KLHL21基因表达水平的变化。[结果]CRISPRi系统有效地抑制HEK293T细胞中荧光素酶报告基因与内源性的KLHL21基因的表达。共表达TetR抑制蛋白可阻断CRISPRi对荧光素酶报告基因表达的抑制作用,在细胞培养基中加入1μg/ml盐酸四环素可解除这种抑制作用。[结论]成功构建了可诱导型CRISPRi系统,可有效抑制真核细胞基因的表达。     

细菌CRISPR/Cas免疫系统的构建及功能鉴定

目的构建细菌CRISPR/Cas免疫系统表达质粒,用于细菌耐药基因水平转移的研究。方法 PCR技术分三段扩增嗜热链球菌LMD-9的CRISPR/Cas基因序列,并依次接入PACYCDuet-1质粒。以体外酶切效率评价其活性。结果经PCR扩增、测序鉴定,成功扩增了完整的CRISPR/Cas系统;在功能活性鉴定中,gRNA剪切靶点DNA酶切条带的灰度值分别为10和3,表明构建的CRISPR/Cas系统质粒具有活性。结论成功构建了细菌CRISPR/Cas免疫系统质粒,为今后用于细菌耐药基因水平转移打下了基础。     

CRISPR/Cas9介导的CD34报告基因293AD细胞系的构建

CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。     

IL-37基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

[目的]克隆白介素-37(IL-37)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体,并分析活性。[方法]用PCR方法扩增IL-37基因5'端上游区3个不同长度的启动子片段,分别克隆入荧光素酶报告基因载体p GL3,构建IL-37基因启动子荧光素酶报告基因质粒。将所构建的质粒转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶报告基因系统分析启动子的转录活性。[结果]754、1 017、2 043 bp等3个IL-37启动子片段正确亚克隆入荧光素酶报告基因载体,重组质粒转染HEK-293细胞后,双荧光素酶活性分析显示1 017 bp的启动子片段具有较强转录活性,约为对照组(空载体p GL3-basic)的10.9倍。[结论]成功克隆IL-37基因启动子,构建了大小为1 017 bp的IL-37基因启动子荧光素酶报告基因载体,为IL-37表达的调控机制的研究提供有效的工具。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

CRISPR/Cas9编辑绒山羊FGF5基因细胞株的建立

拟利用CRISPR/Cas9技术建立编辑FGF5基因的绒山羊细胞株。在FGF5基因的第一外显子设计靶点并合成gRNA靶点引物,构建2个编辑FGF5基因的Cas/gRNA真核表达质粒载体。电穿孔法转染绒山羊成纤维细胞后T7核酸内切酶（T7E1）检测载体活性,选择活性最高的载体转染细胞,单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。经测序分析共获得20个FGF5基因敲除细胞株（包括FGF5^+/-和FGF5^-/-）,总突变率为14.81%。双敲除突变细胞株可作为供体细胞进行重构胚构建,为创造高产绒性状的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。     

人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。     

干扰素γ增强GH3细胞中人生长激素基因表达机制

为了研究干扰素γ(IFN γ)对大鼠垂体GH3细胞中人生长激素 (hGH)基因启动子活性的影响及其可能的作用机制 ,采用荧光素酶报告基因方法 ,将含hGH基因启动子 (- 4 84～ 2bp)和荧光素酶报告基因的表达质粒pGL3 4 84 Luc单独转染或与垂体特异性核转录因子Pit 1蛋白表达质粒 (pcDNA Pit 1 cDNA)或Pit 1反义寡核苷酸 (Pit 1OND)共转染于大鼠垂体GH3细胞中 ,观察加入IFN γ及细胞内信号转导途径的抑制剂后GH3细胞中荧光素酶表达的变化 ,反映其对hGH启动子活性的影响 ;将含不同长度hGH基因启动子序列的荧光素酶表达质粒pGL3 3 80 Luc(- 3 80～ 2bp)、pGL3 2 5 0 Luc(- 2 5 0～ 2bp)、pGL3 1 3 2 Luc(- 1 3 2～ 2bp)和 pGL3 6 6 Luc(- 6 6～2bp)分别转染GH3细胞 ,观察它们对IFN γ的反应 ,以寻找IFN γ影响hGH基因启动子活性的关键序列。结果表明 ,IFN γ (1 0 5u/L ,1 0 6u/L)均能促进大鼠垂体GH3细胞中荧光素酶的表达 ,最高达对照组的 1 3 1 % (P <0 .0 0 1 ) ;在胞内信号转导抑制剂中 ,只有丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号转导途径抑制剂PD980 5 9(4 0 μmol/L) ,能完全阻断IFN γ的促进作用 ;Pit 1蛋白过表达和表达被抑制对IFN γ的促进作用没有影响 ;含不同长度hGH基因启动子序列质粒中 ,只有 pGL3 3 8     

靶向剪切AAVS1位点CRISPR/Cas9腺病毒系统的构建

本研究拟使用腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统靶向剪切AAVS1位点,为实现AAVS1位点基因定点插入奠定基础。设计针对AAVS1位点的gRNA序列,连接到pENTRY-U6-h EF1a-Cas9载体,通过Gateway技术重组到腺病毒骨架质粒pAD,转染293A细胞包装腺病毒。腺病毒感染Hela细胞系,使用T7E1酶切及测序检测AAVS1位点的打靶效率。T7EI酶切结果显示腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统剪切效率达到28.5%。腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统对AAVS1位点成功实施了剪切,为下一步在Hela细胞内进行基因定点敲入及基因治疗奠定了基础。     

小鼠组蛋白H3K4甲基化酶Smyd3启动子荧光素酶报告载体的构建与活性分析

为研究小鼠(Mus musculus)组蛋白H3 K4甲基化酶基因Smyd3转录调控的分子机制,本研究首先通过PCR的方法克隆了5条不同长度的Smyd3启动子5’端缺失片段,与pMD19-T载体连接后,双酶切克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体,构建Smyd3启动子-pGL3-Basic报告基因重组质粒,瞬时转染HEK293细胞48 h后采用双报告基因检测试剂盒检测Smyd3启动子各缺失片段的相对荧光活性.结果表明,本研究成功构建Smyd3启动子5’端缺失片段-pGL3-Basic荧光报告基因重组质粒,所构建的启动子重组子转染组与阳性对照组相比表现出荧光活性,并且pGL3-Smyd3-4的荧光活性最强,是其他的2至4倍左右,pGL3-Smyd3-5的荧光活性最弱.本研究初步确定Smyd3基因的启动子核心区域可能位于-533～-42bp之间,在-2026～-533 bp之间可能存在启动子负调控序列.     

基于CRISPR/Cas9技术构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株及其生物学功能检测

为了探讨Cyr61的生物学功能,该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Cyr61敲低的HEK293T稳定细胞株,并在体外研究Cyr61对HEK293T细胞增殖和凋亡的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,应用http://crispr.mit.edu/在线设计3条Cyr61的导向RNA(guideRNA,gRNA),用LentiCRISPRv2作为载体构建LentiCRISPRv2-gRNA重组质粒并转化至感受态的Stbl3菌体中,经筛选后包装成Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒,利用Cyr61 CRISPR/Cas9 KO质粒和HDR质粒转染HEK293T细胞,加入嘌呤霉素(8μg/mL)进行筛选,通过实时荧光定量PCR技术及蛋白质免疫印迹(Western blot)鉴定出HEK293T敲低Cyr61细胞株;常规培养细胞,利用细胞计数检测试剂盒(CCK8)检测细胞增殖情况,流式细胞技术检测细胞凋亡情况。该研究成功构建出Cyr61敲低HEK293T细胞株,与对照组相比,Cyr61敲低细胞株的增殖明显升高(P0.05),凋亡率明显减少(P0.05)。通过CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建Cyr61敲低HEK293T稳定细胞株,为研究Cyr61基因提供了有效的工具。     

单链退火修复及其在疾病治疗和基因编辑中的作用

DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)对细胞生存是致命的。细胞内经典非同源末端连接(classical non-homologous end joining,C-NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternative non-homologous end joining,A-NHEJ)、重组修复(homology-directed repair,HDR)、单链退火修复(single-strand annealing,SSA)等通路可竞争性修复DNA双链断裂损伤。其中,SSA途径不使用同源染色体或姐妹染色单体,仅依赖于重复序列彼此退火配对,并涉及遗传信息的丢失,是容易出错的修复过程,具有诱变性。相比其他修复途径,在细胞周期S和G_2期中,末端切除暴露出更长的同源重复序列(20 bp),有利于细胞选择SSA途径进行修复。在一些SSA活性升高的同源重组(homologous recombination,HR)缺陷癌症中,癌症细胞可利用SSA途径获得耐药性,也预示着疾病风险的提高。因此,靶向SSA途径的抑制剂具有抑制癌症进展,以及逆转肿瘤细胞对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂耐药的作用,是一种新型的治疗策略,可能成为特定同源重组缺陷癌症风险评估的有力工具。检测SSA活性将有助于更好区分癌症的发生和进展。同时随着基因编辑技术的发展,基于SSA途径的荧光报告基因方法,用于检测规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR-Cas9)系统中引导RNA(gRNA)的特异性和裂解活性被证明是有效、可靠的策略,同时结合CRISPR-Cas9靶向和SSA诱导的DNA编辑,可以特定模式表达多个gRNA并实现多种细胞类型特异性操作和组合遗传靶向。尽管对SSA途径的研究与基于SSA途径的技术应用已取得不错的进展,但仍有许多问题有待阐明。     

小鼠T-bet启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

为了研究T-bet在T细胞中的转录调控机制,并研究其在多发性硬化症中的信号通路,本研究构建小鼠TBX21(编码T-bet)基因启动子区和增强子区萤火虫荧光素酶报告基因载体。在对小鼠TBX21基因5?侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从小鼠基因组中扩增出TBX21基因5?侧翼区–1 000 bp-28 bp片段长为1 028 bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1)和–3 308 bp-–2 000 bp片段长为1308 bp的非编码区保守序列(No-coding conserved sequence,CNS),再用定向克隆的方法将这两个片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10)中,构建出包含小鼠TBX21基因启动子区和CNS区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(p GL4.10-TBX21pr-CNS),电泳与测序鉴定,最后再将p GL4.10-TBX21pr-CNS与内参p RL-TK用lipofectamine 2000共转染293T细胞和Jurkat细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定p GL4.10-TBX21pr-CNS的启动子和增强子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染p GL4.10与内参p RL-TK。结果表明,成功构建出荧光素酶报告基因重组质粒p GL4.10-TBX21pr-CNS。与转染空质粒p RL-TK组相比,293T细胞(P=0.012 2)和Jurkat细胞(P=0.002 2)中转染p GL4.10-TBX21pr-CNS组荧光素酶活性升高。研究结果表明在293T细胞和Jurkat细胞中p GL4.10-TBX21pr-CNS可以表现出启动子活性,为后续小鼠T-bet转录调控研究提供了基本材料。     

稳定表达Cas9蛋白的SW620细胞株构建

摘要 目的：建立稳定表达Cas9蛋白的SW620人结肠癌细胞系的单克隆细胞株,提高基因编辑效率,为利用基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选结肠癌相关致病基因提供细胞工具。方法：用Cas9慢病毒侵染SW620细胞系,用致死剂量的puro筛选5-7天,通过有限稀释法获得单克隆细胞株。提取单克隆细胞基因组进行Sanger测序,筛选出含有Cas9基因序列的单克隆细胞株。利用基于SSA修复荧光素酶的报告系统检测单克隆细胞株中Cas9的编辑活性,并通过细胞增殖实验检测Cas9蛋白的表达是否影响细胞增殖。结果：获得了两个表达Cas9蛋白的SW620单克隆细胞株,并通过Sanger测序验证了Cas9序列;荧光素酶报告系统检测显示单克隆细胞株的Cas9蛋白有较高的编辑活性;细胞增殖实验显示Cas9蛋白的表达对SW620增殖活性影响不大。结论：本研究利用慢病毒感染的方式,构建了稳定表达Cas9蛋白的SW620单克隆细胞株,为后续大规模筛选与人结肠癌相关的基因突变提供了细胞工具。     

利用CRISPR/Cas9技术产生肌肉特异表达Cas9的小鼠胚胎

目的通过CRISPR/Cas9技术获得肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为建立肌肉特异表达Cas9小鼠动物模型奠定基础。方法设计小鼠Rosa26位点sgRNA并通过体外酶切验证活性,同时使用同源重组构建肌肉特异性同源打靶载体;通过显微注射将Rosa26sgRNA与Cas9蛋白注射到小鼠胚胎,通过PCR及测序检测胚胎的编辑情况,同时移植到假孕母鼠体内,待其生产;将同源打靶载体与Rosa26sgRNA和Cas9一起注射到小鼠胚胎,通过PCR检测整合情况。结果体外酶切实验表明,体外转录的sgRNA与Cas9蛋白联合可对靶位点产生编辑作用;成功构建了肌肉特异性同源打靶载体Donor-SP-px459;通过原核注射获得Rosa26基因编辑胚胎,经移植获得Rosa26基因编辑小鼠;注射同源打靶载体后,成功获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶小鼠胚胎。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功获得Rosa26基因编辑胚胎和小鼠,并获得了肌肉特异性表达Cas9蛋白小鼠胚胎,为利用基因打靶构建肌肉特异表达Cas9的小鼠动物模型奠定基础。     

小鼠精胺氧化酶基因启动子结构和功能研究

目的:克隆和鉴定小鼠精胺氧化酶(mSMO)启动子DNA序列.方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总RNA,应用5'-RACE法获得mSMO的转录起始位点;巢式PCR方法克隆含有mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5'端系列截短的mSMO启动子荧光素酶报告质粒;将报告质粒瞬时转染Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性.结果:确定mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中.克隆获得mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5'端系列截短的启动子报告质粒.报告基因分析证实,该上游DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低.结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176～+124bp为mSMO核心启动子区,-615～-176bp区为重要的转录调控区.     

基于CRISPR/Cas9系统构建FOXA2表达示踪体系

利用CRISPR/Cas9系统在基因FOXA2蛋白质编码区后插入绿色荧光蛋白核酸序列,实现对FOXA2基因开启和关闭的示踪。通过靶向序列选择、Cas9靶向质粒及Donor片段的克隆、细胞转染并进行流式细胞荧光分选、阳性细胞有限稀释、富集培养及单克隆细胞的鉴定和转录翻译水平验证等5个方面,进行实验研究。在编辑的乳腺肿瘤细胞MCF-7中,绿色荧光蛋白有效表达;乳腺癌细胞内绿色荧光蛋白的表达水平同FOXA2蛋白的表达水平正相关,且经肿瘤细胞上皮间质转化进程诱导因子EGF的诱导,绿色荧光蛋白和FOXA2表达水平同步降低。方法学上CRISPR/Cas9靶向FOXA2并利用细胞内同源性定向修复插入绿色荧光蛋白序列成功;利用报告基因蛋白表达水平示踪目的基因的开启、关闭及表达量高低结果准确、方法简单,效果明显。     

基于体外组装核糖核蛋白形式的CRISPR/Cas9基因编辑方法研究进展 *

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是近年来发展起来的新型的基因编辑技术,在生物医学领域得到广泛应用。CRISPR/Cas9系统需要在gRNA存在的条件下通过Cas9蛋白实现对基因组的定点编辑,通常情况下以慢病毒感染或质粒转染等方式提供Cas9和gRNA。但是,这些方式容易引起免疫反应及基因片段不可控插入,存在一定的风险,限制了CRISPR/Cas9技术在机体的应用。近年来发展起来的基于体外组装的核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)转导入胞的策略由于快捷安全、编辑的脱靶率低等优势引起广泛关注。对Cas9 RNP的转导方式及其应用进行了总结,并就其目前存在的问题进行探讨,以期为CRISPR/Cas9技术的进一步发展提供依据,为拓展其应用奠定基础。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

呼吸道黏蛋白5AC基因转录表达的顺式调控元件分析

目的：探讨呼吸道黏蛋白（mucin,MUC）5AC基因5'上游序列顺式调控元件在中性粒细胞弹力酶(neutrophil elastase , NE)诱导MUC5AC基因转录表达的调控机制。方法：应用DNA重组技术,构建含萤光素酶报告基因和MUC5AC启动子不同长度片段的嵌合质粒。采用定点突变技术,在嵌合质粒的基础上构建MUC5AC启动子区特殊蛋白（specificity protein）-1和核因子(nuclear factor, NF)-κB结合位点单独突变体,并测定NE刺激的转染细胞荧光素酶相对活性。结果：成功构建了4种含有不同长度MUC5AC基因启动子序列的荧光索酶报告基因质粒。含有启动子序列-1330bp、-689bp、-324bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度较对照组均显著增加,而含有启动子序列-64bp的嵌合质粒荧光素酶相对光强度与对照组相比差异无统计学意义。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导Sp-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：MUC5AC 5'上游序列中-324～-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件Sp-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用,该位点可能作为靶向性基因治疗的关键调控元件。