14型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的研制

将14型肺炎球菌的荚膜多糖(PS)与破伤风类毒素(TT)通过化学方法结合,制备成多糖-蛋白结合疫苗(PS14-TT)。用该结合疫苗免疫小鼠,在小鼠体内产生了高滴度的PS-IgG抗体和TT-IgG抗体,且再次注射后有加强应答效应,表明制备的结合疫苗保留了完好的抗原性,具有胸腺依赖性抗原的特性。     

抗CD133胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价、高特异性的抗CD133胞外区新疆双峰驼来源的多克隆抗体,为制备高亲和力的抗CD133纳米抗体做准备。方法:将CD133胞外区基因序列构建到原核表达载体pET28a中,诱导表达及纯化CD133蛋白,免疫新疆双峰驼及新西兰兔。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot检测多克隆抗体的效价及与CD133特异性结合活性。结果:ELISA测定抗-CD133骆驼源抗体的效价可达到百万以上,通过Western blot检测多克隆抗体可特异性结合CD133蛋白。结论:重组人CD133蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应,为今后构建骆驼免疫单域抗体噬菌体展示文库奠定基础。     

脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白NhhA研究进展

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides,Nm, 以下简称脑膜炎球菌),是引起流行性脑脊髓膜炎疾病的主要病原体。NhhA(Neisseria hia homologue)是Nm的一种寡聚外膜蛋白。研究表明,NhhA在宿主-病原体相互作用中具有重要功能,如参与Nm无症状鼻咽黏膜定植,诱导巨噬细胞凋亡,具有免疫刺激功能等。该蛋白表面暴露,并在许多Nm菌株中都能表达,表明它有希望作为候选疫苗。现对NhhA的分子结构、宿主-病原体相互作用中的功能以及作为疫苗候选物的研究现状等作一概述。     

脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NhhA研究进展

脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides,Nm,以下简称脑膜炎球菌),是引起流行性脑脊髓膜炎疾病的主要病原体。NhhA(Neisseria hia homologue)是Nm的一种寡聚外膜蛋白。研究表明,NhhA在宿主-病原体相互作用中具有重要功能,如参与Nm无症状鼻咽黏膜定植,诱导巨噬细胞凋亡,具有免疫刺激功能等。该蛋白表面暴露,并在许多Nm菌株中都能表达,表明它有希望作为候选疫苗。现对NhhA的分子结构、在宿主-病原体相互作用中的功能以及作为疫苗候选物的研究现状等作一概述。     

人巨细胞病毒pp150抗原区的原核表达及初步应用

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染人体可引起广泛的临床症状,尤其是孕妇和免疫缺陷病人感染HCMV可产生严重的危害[1].传统的减毒活疫苗使用后可能会造成宿主机会性感染或导致肿瘤,因而限制了它的应用.与亚单位疫苗相比,DNA疫苗具有易于构建和制备、稳定性高等特点.多种HCMV病毒蛋白可刺激机体产生相应的抗体,但应选用免疫原性强、特异性好的蛋白抗原基因制备HCMVDNA疫苗.国内外的研究证实[2-5],HCMV的pp150蛋白具有较强的免疫原性.我们用RT-PCR方法扩增了pp150 420～752氨基酸之间多肽片段的编码基因,克隆至原核表达载体,构建了表达pp150抗原决定簇区的工程菌.     

新型冠状病毒S蛋白抗体制备及双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

由SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease 2019,COVID-19)自2019年底暴发以来,已导致上亿人次感染和数百万人死亡,严重威胁着全人类的生命健康。为了建立一种能快速对新冠病毒疫苗中S蛋白抗原进行定量检测的方法,本研究通过免疫山羊制备多克隆抗体作为包被抗体,通过杂交瘤细胞技术制备了S蛋白特异性单克隆抗体并作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法,并验证其线性范围、敏感性、特异性、稳定性及符合率。结果显示,建立的双抗体夹心ELISA检测方法线性范围为1U~64U,相关系数R²大于0.99;特异性良好,敏感性为92.1%;批内和批间变异系数分别为2.5%~11.7%和1.3%~14.8%,检测已知背景样本符合率为96.7%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高、且稳定性和准确性高,可用于新冠疫苗中S蛋白抗原含量测定。     

脂质运载蛋白突变文库的应用及研究现状

脂质运载蛋白（1ipocaan）蛋白家族是一类广泛存在于生物界、与体内小分子物质运输和贮存相关的蛋白质家族。由于其高级结构具有与抗体高级结构类似的特点：由保守区和超变区组成,因此,以脂质运载蛋白为骨架构建的突变文库也成为一个新的研究领域,该文介绍脂质运载蛋白家族的结构特点、脂质运载蛋白突变文库的应用及研究现状。     

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。     

含乙型肝炎病毒S-PreS1 基因的DNA疫苗与蛋白颗粒疫苗联合免疫可增强免疫应答

为研制新型有效的HBV治疗性疫苗,构建了含PreS1与S融合基因的HBV DNA疫苗,即pVRC-HBSS1 (PreS1 21–47 aa融合在S抗原1–223的羧基端),并制备了CHO表达相同结构的蛋白颗粒亚单位疫苗HBSS1。在Balb/C小鼠中采用不同的DNA免疫方式 (即肌肉注射、皮内注射加电转) 初免3次,蛋白颗粒亚单位疫苗 (不同佐剂) 肌肉注射加强免疫1次,然后我们分析比较了各组疫苗所引起的免疫应答特点。抗体检测结果表明：皮内注射结合电转初免组产生的PreS1与 S特异性抗体水平皆高于肌肉直接注射组。进一步还发现DNA疫苗与蛋白颗粒亚单位疫苗两种疫苗联合应用后S抗原特异的细胞免疫应答 (IFN-γ ELISpot分析) 明显高于DNA疫苗或蛋白颗粒亚单位单独应用,其中皮内注射+电转结合蛋白颗粒亚单位疫苗联合免疫组可产生最强的细胞免疫应答。这些研究为新型HBV 治疗性疫苗的优化设计与合理应用提供了依据。     

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204 800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。     

重组杆状病毒表达尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白的研究

构建了表达尼帕病毒(Nipah virus,NiV)囊膜功能糖蛋白F和G的重组杆状病毒rBac-NF、rBac-NG。Western-blot证实大小分别为61kD和66kD的重组融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)分别在rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞中获得表达,并且rNF前体F0可在昆虫细胞内进一步有效裂解为F1(~49kD)和F2;采用兔抗NiV病毒高免血清间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达F和G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。以rBac-NF、rBac-NG感染的昆虫细胞裂解液稀释后直接包被ELISA板,间接ELISA检测兔抗灭活NiV全病毒高免血清中的F和G蛋白特异性抗体,同样具有良好的敏感性和特异性;以rBac-NF和rBac-NG感染昆虫细胞培养物直接免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiVF和G蛋白特异体液免疫反应,产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,杆状病毒表达重组F和G蛋白抗原具有替代NiV全病毒,作为安全、经济、敏感和特异的诊断抗原的潜力,并为重组病毒亚单位疫苗防制尼帕病毒性脑炎的探索研究奠定了基础。     

脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白疫苗对高脂喂养雌鼠体重和糖耐量的影响

目的:构建能诱导出针对脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)特异性中和抗体的疫苗,为高脂诱导下肥胖和胰岛素抵抗的防治新途径提供理论和实验依据。方法:野生型C57BL/6J雌鼠随机分为疫苗组(n=10,高脂饲养)、佐剂组(n=10,高脂饲养)和空白对照组(n=10,普通饲养),分别予以皮下注射生物合成的FABP4蛋白、佐剂和磷酸盐缓冲液,观察比较各组抗体滴度、安全耐受性和体重、摄食量、空腹血糖、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、糖耐量实验血糖曲线下面积(AUC)等指标。结果:疫苗组小鼠产生了高滴度的FABP4特异性抗体,并于第3轮加强免疫后达到平衡状态。首次免疫16周后,疫苗组小鼠体重高于空白对照组,但明显低于佐剂组(P<0.05);日平均摄食量高于空白对照组(P<0.05),与佐剂组无差异(P>0.05);空腹血糖、HOMA-IR、腹腔葡萄糖耐量实验AUC均明显低于佐剂组(P<0.05),与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论:以FABP4作为抗原免疫小鼠,可产生高滴度特异性抗体IgG,有效降低高脂喂养野生型雌性小鼠体重、空腹血糖、HOMA-IR和血糖AUC等指标,为高脂诱导的肥胖和胰岛素抵抗的治疗提供了新的途径和初步证据,可进行深入研究。     

高效价猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白多克隆抗体的制备及应用

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)衣壳蛋白(Capsid protein,Cap)是病毒主要的抗原蛋白,在病毒感染和宿主免疫应答中起重要作用。为了制备抗PCV2b Cap蛋白的高效价多克隆抗体,利用大肠杆菌表达系统对不含核定位信号肽的PCV2b Cap进行了原核表达,获得了可溶性重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备抗血清,并进一步以辛酸-硫酸铵沉淀法提纯IgG。ELISA检测显示所制备抗体效价可达到1∶10~7,表明抗体具有较高效价。应用该抗体对人工感染PCV2b的PK-15细胞、小鼠组织进行了免疫印迹、间接免疫荧光和免疫组织化学检测,结果表明该抗体在多种检测方法中均能与目的抗原发生特异性结合。该研究制备的高效价抗体为PCV2b的临床检测及科学研究提供了候选工具。     

新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM /IgG抗体检测试剂的研制及性能评价

目的:建立新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)IgM /IgG胶体金抗体联合检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法: 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,分别用刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(receptor binding domain, RBD)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)作为标记抗原,硝酸纤维素膜上包被鼠抗人IgM单抗(M线)和鼠抗人IgG单抗(G线),并用二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)和兔抗DNP多抗为独立C线质控系统制备胶体金检测试剂;比较RBD蛋白和NP蛋白临床测试符合率,选取较优抗原制备检测试剂,对试剂交叉、干扰反应性,加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果: RBD蛋白临床测试总符合率 98.48%(389/395);NP蛋白临床测试总符合率89.11%(352/395),RBD蛋白总符合率高于NP蛋白。选用RBD蛋白制备检测试剂盒,与13种常见病原体抗体阳性样本均无交叉反应;样本中的甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMA)、抗核抗体(ANA)对测试结果无干扰。试剂盒50℃加速破坏6周稳定。临床确诊样本及排除样本测试,IgM灵敏度为78.31%(65/83),特异性为98.90%(721/729);IgG灵敏度为92.77%(77/83),特异性为99.31%(724/729);IgM和IgG联合检测灵敏度为92.77%(77/83),特异性为98.35%(717/729);一致性检验Kappa值为0.883 0,P<0.05。结论: 2019-nCoV IgM/IgG抗体检测试剂(胶体金法)检测性能的特异性和灵敏度高,检测速度快,操作便携,可作为已有的2019-nCoV核酸检测法的补充手段。     

新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG抗体检测试剂的研制及性能评价

目的:建立新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV) IgM/IgG胶体金抗体联合检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,分别用刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(receptor binding domain,RBD)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)作为标记抗原,硝酸纤维素膜上包被鼠抗人IgM单抗(M线)和鼠抗人IgG单抗(G线),并用二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)和兔抗DNP多抗为独立C线质控系统制备胶体金检测试剂;比较RBD蛋白和NP蛋白临床测试符合率,选取较优抗原制备检测试剂,对试剂交叉、干扰反应性,加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果:RBD蛋白临床测试总符合率98.48%(389/395); NP蛋白临床测试总符合率89.11%(352/395),RBD蛋白总符合率高于NP蛋白。选用RBD蛋白制备检测试剂盒,与13种常见病原体抗体阳性样本均无交叉反应;样本中的甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMA)、抗核抗体(ANA)对测试结果无干扰。试剂盒50℃加速破坏6周稳定。临床确诊样本及排除样本测试,IgM灵敏度为78.31%(65/83),特异性为98.90%(721/729); IgG灵敏度为92.77%(77/83),特异性为99.31%(724/729); IgM和IgG联合检测灵敏度为92.77%(77/83),特异性为98.35%(717/729);一致性检验Kappa值为0.883 0,P 0.05。结论:2019-nCoV IgM/IgG抗体检测试剂(胶体金法)检测性能的特异性和灵敏度高,检测速度快,操作便携,可作为已有的2019-nCoV核酸检测法的补充手段。     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

本文旨在制备小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglo binbinding protein,mUGBP)多克隆抗体,为后续研究工作奠定基础。通过生物信息学分析方法预测mUGBP蛋白的跨膜结构、理化特性、疏水性等因素,设计出两段多肽,分别与匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)交联后免疫新西兰兔,结果显示其中一个含13个氨基酸残基的多肽序列(221st～233rd)可用作抗原免疫动物,并成功获得高效价的抗mUGBP多克隆抗体。通过ELISA法检测其效价为1:108,亲和层析纯化后Westernblot检测抗体特异性,并将制备的抗体应用于免疫印迹及人和小鼠肺组织免疫组织化学和免疫荧光检测,结果显示本研究制备的抗体具有特异性,且用该抗体成功在人和小鼠气道上皮细胞和肺血管内皮细胞检测到UGBP蛋白表达。结果表明,本研究通过生物信息学方法成功预测了抗原表位,并据此预测成功制备了高效价、高特异性的抗mUGBP多克隆抗体。     

不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平分析

目的研究伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗免疫效果及不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平,以确定合适的免疫剂量。方法将150只清洁级NIH雌性小鼠随机分为5组,分别为A组(0.625μg结合疫苗组)、B组(1.250μg结合疫苗组)、C组(2.500μg结合疫苗组)、D组(2.500μg多糖组)及阴性组(10mmol/L PBS),每组30只;另领取10只为空白对照(不接种)。A、B、C、D组及阴性组小鼠经腹股沟皮下注射,剂量0.1 m L/只,每隔2周免疫1次,共免疫3次,每次免疫后第7天采血。采用ELISA检测小鼠血清抗体效价,同时对不同剂量伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗在小鼠体内诱导的抗体效价进行分析比较。结果与D组相比,A、B、C三组诱导的抗体水平与之均有统计学意义(P<0.05);A组与B组、A组与C组之间的抗体水平也具有统计学意义(P<0.05),而B组与C组之间的抗体水平无统计学意义(P>0.05)。说明与多糖疫苗相比,伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗能够诱导更高的抗体水平,且具有明显的剂次加强效应。同时证明1.250μg的伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗可诱导与2.500μg伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗相同的抗体水平。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗的两种免疫剂量在小鼠体内可诱导相同的抗体水平,在选择接种剂量时,可致免疫应答的无统计学意义的低剂量可能是较为经济和安全的选择。     

疫苗的研究:从概念到早期临床试验

<正>进入21世纪,一系列微生物学和分子生物学的进步允许用于新疫苗的抗原被明确地鉴定、设计、生产和投递,旨在优化诱导对明确的免疫原的保护性免疫应答。有关免疫系统正常工作和宿主-病原体相互作用的新认识促进了疫苗设计的合理性。疫苗的设计工具箱包括用全病原体、蛋白亚单位、多糖和病原体样颗粒来制备的疫苗,病毒/细菌载体的使用,加上以增强和扩展免疫应答的免疫佐剂和结合     

人类肠道病毒71型亚单位疫苗壳聚糖佐剂作用的研究

为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平,中和试验检测血清中和抗体滴度,并通过抗原刺激体外培养的兔脾淋巴细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平评价rVP1口服免疫效果。结果显示,单纯口服rVP1蛋白仅可诱导产生较低水平的血清IgG和粘膜IgA抗体,而含佐剂疫苗组与单纯抗原免疫组差异显著,并可诱导产生中和抗体。细胞免疫检测结果显示rVP1含佐剂组兔脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显高于未加佐剂组。本研究为研制EV71VP1口服疫苗奠定了基础。     

重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒中国株B'亚型Gag蛋白及免疫效果观察

为筛选用于我国HIV疫苗的候选基因,利用痘苗病毒载体构建表达HIV-1 B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组病毒rVV-RL42gag,并免疫BALB/c小鼠,检测其诱导的特异性抗体及中和抗体,同时检测其诱导的特异性CTL及与中国流行株C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.结果显示:重组病毒能很好地表达Gag蛋白,它具有与7株单克隆抗体结合的抗体表位;电镜下可观察到Gag蛋白形成的颗粒.rVV-RL42gag免疫小鼠后能诱导产生高滴度的特异性抗体和CTL,抗体具一定的中和活性,且检测到与C(B′/C重组)亚型和国际流行株A亚型之间的CTL交叉反应.这些结果表明,rVV-RL42gag具有良好的免疫原性,可进一步构建表达HIV B′亚型中国流行株RL42的Gag蛋白的重组痘苗病毒作为候选疫苗.