轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒规模化生产培养工艺的建立

目的通过对发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（简称“新布尼亚病毒”）进行规模化生产培养工艺研究,为新布尼亚病毒规模化生产提供有力支持。方法采用细胞工厂培养Vero细胞,待其长成致密单层后,取工作种子批新布尼亚病毒毒种接种细胞,采用连续收获或细胞病变充分时收获培养液上清的方法收获病毒,并以病毒滴度、抗原含量作为评价指标选择基础培养基、培养基pH、人血白蛋白添加浓度、接种细胞日龄、接种病毒MOI以及病毒培养温度。结果按0．01-0．001MOI接种3-4日龄Vero细胞,病毒培养液选择含0．3％人血白蛋白pH7．6-7．8的DMEM溶液,35℃培养7d收获,病毒收获液病毒滴度7．87LgCCID50／mL、抗原含量170．1μ/mL。结论初步建立了新布尼亚病毒规模化生产培养工艺,为后续工业化生产提供了数据支持。     

细胞工厂培养轮状病毒基因重配株Ls(G3型)条件的优化研究

目的以细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株Ls的可行性研究。方法采用细胞工厂与相应的转瓶培养工艺作对比,比较两种容器内细胞生长状态与病毒收获液滴度,并对细胞工厂培养条件进行了优化。结果以相同浓度接种细胞时,细胞工厂4 d长成单层,转瓶却需要7 d,经细胞仪计数后单位面积内细胞密度相当;以相同MOI接种病毒后,转瓶内的病毒于第7天病毒滴度达到峰值,细胞已完全脱落;细胞工厂于第3天病毒滴度达到峰值,并实现了3次收获。细胞工厂每次收获的病毒液滴度都稳定在一定范围,与转瓶相当。另外,细胞工厂培养条件优化结果表明,Vero细胞最佳接种浓度为3.0×104细胞/cm2,接种病毒的最适MOI为0.02~0.04。结论使用细胞工厂培养Ls株病毒不仅提高了效率,而且减少了培养空间,可替代转瓶规模化生产轮状病毒疫苗。     

细胞工厂在轮状病毒基因重配株LD9培养中的应用初探

为了探索用细胞工厂代替转瓶培养轮状病毒基因重配株LD9及收获高滴度的LD9病毒原液和提高产量的可行性,分别在2层4、层细胞工厂和3L1、5L转瓶培养Vero细胞,比较两种容器内细胞的生长状态。结果显示,以相同活细胞数2.5×104/ml同时接种两种不同培养容器时,细胞工厂培养3d已长成单层,而转瓶培养需5d;对两种容器长满单层时的细胞经胰酶消化后通过细胞仪计数、分析,结果显示,两种容器培养细胞长成单层时的单位面积细胞密度相当;对长成致密单层细胞的两种容器以相同的MOI(MOI=0.1)接种LD9病毒,转瓶培养的病毒于第8d病毒滴度达到高峰,为6.0～6.5 lgCCID50/ml;细胞工厂第5d病毒滴度达高峰,为6.5 lgCCID50/ml,并于第9d病毒滴度再次达到峰值,为6.0～6.5 lgCCID50/ml,实现二次收获病毒。     

生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。     

狂犬病病毒CVS-11株培养工艺的优化

目的通过优化培养工艺提高狂犬病病毒CVS-11株的滴度。方法 BSR细胞(1.5×106个细胞/孔)以不同感染复数(MOI 0.100、0.050、0.010、0.005和0.001)接种CVS-11,培养72 h收获,测定病毒滴度;以0.005和0.001 MOI,分别接种不同密度的BSR细胞(1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、8×105和10×105个细胞/孔)培养CVS-11,于72 h收获,测定病毒滴度;以5×105个细胞/9.6 cm2和0.001 MOI,分别在48、72、96、120和144 h收获病毒,测定病毒滴度;并通过正交实验获得最佳培养条件;由6孔板(9.6 cm2/孔)放大到T75 cm2瓶培养,验证正交实验结果。结果细胞密度对CVS-11病毒滴度有一定的影响,以4×105细胞/9.6 cm2获得的CVS-11病毒滴度最高。以相同的细胞数量和收获时间,CVS-11病毒的滴度随着MOI的减小而增大。固定细胞数和MOI,病毒滴度在培养早期随时间的延长而增加,直至96 h后,随着时间的延长滴度下降。正交实验的结果表明3个因素对滴度的影响顺序是MOI细胞数量收获时间,放大培养验证了正交试验的结果。结论以4×105个细胞/9.6 cm2,0.001 MOI,培养96 h获得的CVS-11滴度最高。     

病毒感染复数对狂犬病毒PM株增殖的影响

目的探讨不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的狂犬病毒PM株在人二倍体细胞(2BS株)中增殖的影响,确定感染复数。方法将狂犬病毒PM株按照MOI 0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20接种至2BS细胞中,用显微镜观察接种病毒后细胞的形态变化;培养3~5 d后,第一次收获病毒液;更换培养液继续培养3~4 d后,进行第二次收获。采用小鼠脑内滴定法测定狂犬病毒滴度,通过NIH法测定灭活病毒液的效价。结果当MOI为0.05~0.10时,细胞圆缩30%~40%,细胞能维持较好的生长形态,可收获病毒,病毒收获液的滴度较高(5.0lg LD50/m L),且灭活后病毒液的效价较高(4.0IU/m L)。结论确定狂犬病毒PM株在人二倍体2BS细胞增殖的适宜MOI,为人用狂犬病疫苗生产工艺的优化提供了依据。     

高压静电检漏法对口服轮状病毒活疫苗包装无损密封性检查

目的探索高压静电检漏法对口服轮状病毒活疫苗包装无损密封性检查的可行性。方法采用高压静电检漏法对口服轮状病毒活疫苗包装密封性进行检查,并观察此方法对疫苗有效成分的影响。结果口服轮状病毒活疫苗经18 000 V和14 000 V高压静电检测显示,导电电流值均极低;病毒滴度结果均在6.0~6.5 lg CCID_(50)/mL之间,热稳定性试验病毒滴度下降值在0.5~1.0 lg之间,均符合质量标准,且与对照组(A组和B组)检测结果差异无统计学意义(P0.05)。结论高压静电检漏法用于口服轮状病毒活疫苗包装无损密封性检查是可行的。     

不同代次牛肾原代细胞培养轮状病毒的比较研究

口服轮状病毒活疫苗(LLR株)生产用细胞基质为新生小牛肾原代细胞。原始的初代细胞(P0)产量小,一对牛肾平均生产7瓶细胞。将原始的初代细胞传代可使细胞产量显著增加,传代后(P2代)细胞产量可由7瓶增加为96~112瓶,细胞核型检查传至P5代的细胞染色体数目与初代细胞一致。细胞培养物均一性提高。P0代与P2代细胞病毒培养物滴度分别在6.2±1.5和6.5±0.5lgCCID50/ml,使用P2代细胞培养病毒,产量增加10~15倍。提高了疫苗生产的可控性和质量,生产规模显著放大,经济效益明显。     

转瓶培养与生物反应器微载体培养乙脑病毒的比较

分别用15L转瓶与15L生物反应器微载体(2.5g/L CytodexⅢ)系统培养Vero细胞并接种乙型脑炎病毒(简称乙脑病毒)。转瓶培养Vero细胞7~8d,细胞数最高能达到8×108;当单层细胞长至3.0~4.5×108时接种乙脑病毒,病毒滴度能达到6.5~6.98 lg PFU/ml,并能够连续收获4~5次;采用微载体系统培养Vero细胞,细胞密度最高能达到170×108;当单层细胞长至60~70×108时接种乙脑病毒,病毒滴度能达到7~7.5 lg PFU/ml,并能够连续收获13~15次。两种方式培养的乙脑病毒收获液分别经灭活、浓缩、柱层析纯化后制备Vero细胞乙脑纯化疫苗,各项检定指标均符合《中国药典》的相关要求。     

应用细胞工厂建立人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺

目的为提高生产效率、增加原代地鼠肾细胞单产量及狂犬病病毒产量,建立人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）连续培养多次收获工艺。方法选用12-14日龄SPF地鼠,无菌取肾经消化,制备成细胞悬液,分装到40层细胞工厂并培养细胞成单层;接种狂犬病病毒固定毒aG株,连续培养病毒并多次收获。分别对同一细胞批制备的多个单次病毒收获液的免疫原性、病毒滴度和地鼠肾细胞蛋白质含量进行检测。结果用40层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和狂犬病病毒,细胞接种浓度为1．0×10。～1．5x10。cells／mL,（36±1）℃培养72h成致密单层;按0．1MOI病毒接种,可进行6次收获病毒;多个单次病毒收获液病毒滴度均不低于6．0lgLD50／mL;免疫原性检查保护指数不低于100;地鼠肾细胞蛋白质残留量随着收获次数的增加而不断降低。结论用细胞工厂建立了人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺,能显著提高地鼠。肾单产量,增加产能。     

两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。     

水痘减毒活疫苗(VZV84-7株)病毒培养时间优化

目的:优化水痘减毒活疫苗(VZV84-7株)的病毒培养时间。方法:按固定MOI区间0.001~0.01感染细胞;从病毒培养70h起,以5h为间隔分5组收获病毒,采用蚀斑法对病毒收获物进行病毒滴定,通过比较,获得滴度较高病毒收获物的培养时间;再根据此时间以1h为间隔分5组进行实验,用显微镜观察记录病变量及病变细胞情况,采用蚀斑法测定病毒收获物滴度。结果:病毒培养70~90h时,随病毒培养时间的延长,病变量和病毒收获物滴度出现先升高后降低的现象,分别在培养80h和85h时获得较高滴度的病毒收获物;病毒培养82~86h时,病变量和病毒收获物滴度差异不明显。结论:病毒培养时间在82~86h间能获得滴度较高的病毒收获物。     

肠道病毒71型在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征

目的:利用噬斑法比较肠道病毒71型(EV71)在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征。方法:首先探讨培养基类型、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)及甲基纤维素(MC)含量对EV71噬斑形成的影响,得到最适营养覆盖物配比;进一步,EV71以感染复数(MOI)为0.1分别接种RD细胞和Vero细胞,收集接种后不同时间点的细胞培养液,噬斑法测定各时间点培养液上清中的病毒滴度,并绘制log2(病毒滴度)-时间图,对比分析EV71在2种细胞中的增殖动力学特征。结果:终浓度含1%MC和2%FBS的MEM(1×)或DMEM(1×)为EV71噬斑形成的最适营养覆盖物;EV71在RD细胞和Vero细胞中的增殖周期均约为12 h,MOI=0.1时,EV71在RD细胞中的增殖活动较Vero细胞中活跃,增殖效率比Vero细胞中高2个数量级。结论:用RD细胞扩增EV71比Vero细胞更具优势。     

pH值对沼液培养的普通小球藻生长及油含量积累的影响

以50％的沼液为普通小球藻的全营养培养基,考察培养基的起始pH值对小球藻生长及油脂含量的影响,普通小球藻对不同初始pH的沼液中氮、磷的去除情况。设定了2组实验,一组只调节初始接种培养液的pH,分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5;另一组将培养液pH分别固定在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,pH用稀HCl和NaOH进行调节。研究发现在pH 6.5和pH 7.0的偏酸环境有利于小球藻生长,而pH在7.0~8.5的偏碱性条件下有利于小球藻油脂的积累,因此综合小球藻生长和油脂积累2个因素,得到最适合小球藻生长和油脂积累的pH为7.0。培养结束后沼液中氮磷的去除率分别达到了95％和97％,沼液中的总氮由原来的134.91 mg/L降至4.86 mg/L,总磷由10.19 mg/L降到0.32 mg/L。     

Vero细胞培养A/Shanghai/CN02/2013(H7N9)Va流感病毒适宜条件研究

目的:优化Vero细胞培养H7N9流感病毒的培养条件,建立细胞培养病毒高产培养系统。方法:采用不同病毒接种MOI、培养温度、pH值和TPCK胰酶等条件优化培养H7N9流感病毒Vero细胞适应株A/Shanghai/CN02/2013(H7N9)Va的条件,并将其连续传代后扩大至细胞工厂大规模培养。结果:Vero细胞高产H7N9流感病毒培养条件为DMEM/F12和MEM以1∶1混合,并添加0.3 mg/mL牛血清白蛋白、1%谷氨酰胺、0.5%双抗和1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶,pH为7.4时,连续传代病毒血凝效价保持在512,扩大至细胞工厂大规模培养病毒产量稳定。结论:建立的Vero细胞培养H7N9流感病毒条件,能够持续稳定高产,并适用于细胞工厂大规模培养,有望用于H7N9流感细胞疫苗的大规模制备。     

应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒初探

目的应用生物反应器培养Vero细胞制备EV71病毒。方法以3 L生物反应器采用4 g/L、8 g/L Cytodex-1微载体培养比较Vero细胞比生长率,并以4 g/L微载体培养EV71病毒。结果 4 g/L微载体培养Vero细胞3～4 d微载体细胞密度达2.3×106/mL,按0.001的感染复数(MOI)接种EV71病毒,病毒收获液的滴度最高达7.90 lgPFU/mL,较静置培养平均高出0.92 lgPFU/mL。结论初步建立了3 L生物反应器微载体培养Vero细胞制备EV71病毒的工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

LLR株口服轮状病毒活疫苗在制品稳定性观察

对LLR株口服轮状病毒活疫苗生产中各阶段产物(在制品)放置于-20℃、2～8℃,进行稳定性观察,用细胞微量病变滴定法(CCID50)结合酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其病毒感染滴度。结果显示,LLR株口服轮状病毒活疫苗单一收获物-20℃放置18个月,病毒滴度不低于5.50logCCID50/ml,原液-20℃放置18个月,病毒滴度不低于5.50logCCID50/ml。2～8℃存放49d,疫苗原液的病毒滴度不低于5.75logCCID50/ml,疫苗半成品病毒滴度不低于5.50logCCID50/ml。结果表明,LLR株口服轮状病毒活疫苗生产各阶段产物在-20℃及2～8℃存放,其稳定性良好。     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术。在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6~7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0~8.5logLD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到《中国生物制品规程》2000年版要求。实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行。     

牛肾组织及其培养物的不同消化法效果评价

为了比较不同消化液及消化方式对牛肾皮质组织和培养后形成单层细胞的消化分散效果并确定最适消化液和消化方式,分别用0.25%胰蛋白酶和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA两种消化液,消化牛肾皮质组织及其培养形成的单层牛肾皮质细胞。牛肾皮质组织采用热(37℃)和冷(4℃)两种消化方式;经培养形成单层的牛肾皮质细胞采用室温(25℃)消化。结果显示,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液热消化牛肾组织时,分散获得牛肾皮质细胞的活细胞数、存活率、贴壁率均优于其他消化方法,差异显著(P0.05)。培养形成的单层牛肾皮质细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液的消化速度明显快于用单一0.25%胰蛋白酶消化液的消化速度,统计学分析显示具有显著性差异(P0.01),两种消化液消化所得细胞的存活率及贴壁率前者要更高,差异显著(P0.05)。