非核糖体肽Skyllamycin B生物合成中I型硫酯酶底物杂泛性的初步研究

[背景] Skyllamycins是一类从链霉菌中发现的具有血小板生长因子抑制和生物膜抑制作用的非核糖体肽类,其环肽环合反应是由非核糖体肽合成酶中的硫酯酶功能域催化完成。[目的] 克隆和表达Skyllamycin非核糖体肽合成酶最后一个模块中的硫酯酶（Skyxy-TE）基因,合成Skyxy-TE底物类似物,通过体外催化实验表征Skyxy-TE的底物杂泛性。[方法] 采用Ligation Independent Cloning（LIC）方法,从一株含有Skyllamycin B生物合成基因簇的链霉菌Streptomyces sp.PKU-MA01239中克隆和表达skyxy-TE,通过镍离子柱亲和层析纯化Skyxy-TE。运用固相多肽合成法合成2个底物类似物1和2,进行Skyxy-TE的体外催化实验。[结果] 通过对Skyxy-TE的表达纯化,获得了纯度较好的可溶性蛋白;通过固相多肽合成,得到了能够模拟Skyllamycin B底物类似物的化合物1和2,硫酯酶蛋白体外催化化合物1和2得到了化合物3和4,化合物3和4通过核磁共振和高分辨质谱确认为环肽。[结论] Skyllamycin B生物合成中Skyxy-TE表现出一定的底物杂泛性,可以识别底物类似物催化环化反应,该研究为将来利用化学-酶联法制备更多环肽类似物提供了依据。     

非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化

非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPSs）能以多载体巯基化模板机制合成各种结构复杂、种类繁多的次生代谢非核糖体环肽.根据环肽末端环化的方式,可分为两大类：大环内酯型和内酰胺型.负责非核糖体环肽最终环化的硫酯酶（thioesterase,TE）属于α/β水解酶超家族.该家族包括：脂酶、蛋白酶、酯酶等,其共有特征是含有保守的催化三元件（Ser-His-Asp）,起到终止反应和释放产物的功能. TE具有区域定向性（regiospecific）、化学定向性（chemospecific）及立体定向性（stereospecific）的特点,在非核糖体肽（nonribosomal peptide,NRP）的合成反应中具有决定性作用,直接影响到最终环肽的生成. 同时,TE由于其特有的环化和水解的双重活性,在体外的线性多肽环化中越来越受到众多学者的关注. 综合国内外相关文献,本文着重从TE介导下的产物释放机制和影响因素两个方面综述非核糖体末端硫酯酶的研究进展及其应用.     

非核糖体肽合成酶装配机制研究进展

非核糖体多肽(nonribosomal peptide,NRP)是天然生物活性产物一大类群,组成结构多样,具有多种重要的药用价值。在微生物中催化非核糖体多肽生物合成的是非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS),NRPS是一类模块酶系,模块的组装在非核糖体多肽合成及其环化中起着关键作用。本文主要对非核糖体肽合成酶常规模块组装模式及3种非常规合成模式进行综述,为深入了解和应用非核糖体肽合成酶在抗生素类生物活性物质中的作用提供理论依据。     

非核糖体肽合成酶装配机制研究进展CSCD

非核糖体多肽(nonribosomal peptide,NRP)是天然生物活性产物一大类群,组成结构多样,具有多种重要的药用价值。在微生物中催化非核糖体多肽生物合成的是非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS),NRPS是一类模块酶系,模块的组装在非核糖体多肽合成及其环化中起着关键作用。本文主要对非核糖体肽合成酶常规模块组装模式及3种非常规合成模式进行综述,为深入了解和应用非核糖体肽合成酶在抗生素类生物活性物质中的作用提供理论依据。     

海绵共生萎缩芽孢杆菌C89 PPTase bap基因的异源表达

【背景】磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化非核糖体肽合成酶(NRPS)中肽酰载体蛋白(PCP)从无活性的脱辅基形态转化为有活性的全辅基形态,从而启动非核糖体肽类化合物的生物合成。【目的】鉴定贪婪倔海绵共生萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap,验证Bap激活NRPS中PCP的能力。【方法】通过BLAST和氨基酸多序列比对鉴定萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap。将bap基因在sfp基因突变株枯草芽孢杆菌168中异源表达,通过重组菌枯草芽孢杆菌168-bap的代谢物检测非核糖体肽类化合物Surfactin。【结果】Bap为Sfp型PPTase,检测到重组菌枯草芽孢杆菌168-bap中Surfactin的产生。【结论】本研究为海洋萎缩芽孢杆菌中NRPS基因簇的异源表达奠定了基础。     

羊毛硫肽的高通量工程改造方法新进展

羊毛硫肽(lanthipeptide)是由核糖体合成并经翻译后修饰产生的肽类天然产物,具有丰富的分子结构和多样的生物活性.新型羊毛硫肽是活性药物的重要来源,可以通过基因组挖掘和工程改造获得.羊毛硫肽前体肽由基因编码,同时其合成酶具有较高的底物杂泛性.基于这些特征,可以对羊毛硫肽的生物合成过程开展高通量工程改造,从而快速...     

海洋来源节菱孢菌ZSDS1-F3中PKS-NRPS类天然产物挖掘

【目的】以基因组信息为指导,定向激活海洋来源真菌Arthrinium arundinisZSDS1-F3中沉默的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)类生物合成基因簇,鉴定次级代谢产物结构。【方法】通过启动子工程和异源表达的策略激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,实现目标化合物的分离,通过HR-ESI-MS和NMR数据分析鉴定产物结构,结合基因重组和生物信息学分析结果推导化合物的生物合成途径。【结果】依据基因组生物信息学分析,从海洋来源真菌A. arundinis ZSDS1-F3中选取一个编码PKS-NRPS类次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,在宿主Aspergillus nidulansA1145中实现了基因簇的异源表达,从中分离到2个新化合物,并推导了其生物合成途径。【结论】基因组信息指导下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,加快真菌中新颖天然产物的发现步伐。     

枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展

革兰氏阳性菌模式生物--枯草芽孢杆菌能分泌多种肽类及由肽类衍生的抗菌活性物质,按合成途径不同,可分为核糖体肽和非核糖体肽。其中,非核糖体肽分子量较小,一般为3000Da以下,其生物合成是通过多功能复合酶系--非核糖体肽链合成酶来完成的,多发生在菌体生长停止之后;而核糖体肽分子量较大,其合成多于菌体快速生长时期。非核糖体肽链合成酶和核糖体肽的合成及其调控均需基因参与,而这一系列基因就构成了各种抗菌肽生物合成的基因簇。对核糖体肽和非核糖体肽的生物合成及其相关调控机制进行了综述。     

非核糖体肽的生物合成研究进展

非核糖体肽(nonribosomal peptide, NRP)是由多种微生物通过非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)等催化合成的一类小分子多肽类次级代谢产物,具有抗菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,是一类重要的微生物药物,具有很高的临床应用价值。从目前已发现的小分子多肽类天然药物出发,综述了该类物质的生物功能、合成组装机制以及近年来在工程改造方面的进展,并提出了未来研究发展方向,对进一步通过组合生物合成等方式高效合成更多种类的小分子多肽类活性物质具有借鉴意义。     

真菌聚酮化合物生物合成研究进展

具有广泛生物活性的真菌聚酮化合物因具有复杂的化学结构,其生物合成途径一般包含多样且新颖的酶催化反应。文中主要综述了2013-2016年来源于还原性聚酮合成酶(HR-PKSs)、非还原性聚酮合成酶(NR-PKSs)、聚酮-非核糖体多肽合成酶(PKS-NRPSs)和还原性-非还原性聚酮合成酶(HR-NR PKSs)杂合型等四大类型的真菌聚酮类化合物的生物合成研究进展。众多真菌聚酮类化合物生物机理的阐明,为未来新型真菌聚酮类天然产物生物合成基因簇的挖掘、新结构化合物的发现及其类似物的研究提供了方向和理论基础。     

非核糖体肽合成酶催化模块的重构与多肽合成

天然次级代谢产物是重要的药物来源,非核糖体肽(non-ribosomal peptide, NRP)是自然界中广泛存在的次级代谢产物,其多样的化学结构使其具有多种生物活性,如抗炎、抗肿瘤、抗病毒等。基于非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases, NRPS)模块化线性合成多肽的原理对其催化模块进行改造、重组,定向设计多肽的生物合成途径以获得目的多肽已成为一个研究热点。然而杂合NRPS存在催化模块无法加载目标氨基酸或多肽合成效率显著降低等诸多问题,限制了其应用。近年来,NRPS腺苷酰化域(adenylation domain, A域)及缩合结构域(condensation domain, C域)的底物选择性、NRPS亚基间对接域(docking domain, DD)和模块间连接区(linker)的研究已取得较大突破。从C域对底物的选择性及以不同融合边界进行催化单元替换两方面进行综述,介绍NRPS催化模块重构的研究进展,并概述了各替换方案的优点与局限性。     

哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶的体外功能

【目的】系统鉴定哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶(Acyl-ACP synthetase,Aas S)以不同链长游离脂肪酸和非脂肪链羧酸作为底物的体外催化反应。【方法】利用非变性蛋白质凝胶电泳和紫外分光光度计法从定性和定量两个方面分析了Aas S的体外催化功能与活性。【结果】Aas S能够催化不同链长直链的自由脂肪酸合成脂酰-ACP,其中以C6–C12作为底物时活性最高;以羟基脂肪酸作为底物的情况下,Aas S催化C8–C14的羟基脂肪酸有较高的活性。非脂肪链羧酸类作为底物的反应中,20种蛋白质氨基酸、苯甲酸和水杨酸均可以作为Aas S的底物,合成相应的脂酰-ACP。【结论】本研究系统地证明了哈氏弧菌脂酰-ACP合成酶(Aas S)对不同底物的不同催化活性,为生物体内氨基酸代谢和菌黄素合成代谢的研究提供了可行性的分析依据。     

南沙链霉菌来源细胞色素P450酶CYP154C34的表征及生物转化

【目的】P450酶作为一种多功能生物催化剂,可在温和条件下高区域和立体选择性地催化复杂化合物中未活化的C-H键,因此P450酶在化工原料合成、环境污染物降解及药物合成等领域都具有重要作用。本文对南沙链霉菌基因组中的一个新颖的P450酶CYP154C34进行研究,通过构建异源表达和全细胞生物转化重组菌探究其功能。【方法】构建2种全细胞生物转化BL21(DE3)重组菌(含p ET28a-CYP154C34-RhFRED和pET28a-CYP154C34+pACYCDuet-Pdx/PdR)和1种异源表达BL21(DE3)重组菌(含pET28a-CYP154C34)。通过全细胞生物转化的方式筛选底物,分析催化功能及产物结构。比较2种全细胞生物转化重组菌和体外酶反应对底物的转化率。分析CYP154C34和不同底物及底物类似物的亲和力。【结果】通过底物筛选和产物鉴定发现CYP154C34可催化包括孕酮、睾酮、雄烯二酮在内的9种甾体化合物16α位羟基化。通过2种不同还原伴侣的全细胞体系及体外酶反应对底物转化率的比较,发现含有pET28a-CYP154C34-RhFRED的BL21(DE3)重组菌的...     

非核糖体肽合成酶工程改造研究进展

非核糖体肽合成酶合成的非核糖体肽类天然产物具有丰富的结构和多样的功能,在医药、农业、工业等领域具有广泛的应用潜力.利用合成生物技术工程改造非核糖体肽合成酶,在微生物细胞工厂中组合生物合成新型非核糖体肽分子顺应绿色化学的发展理念,是国内外学者关注的热点.文中归纳了3种不同的非核糖体肽合成酶工程改造策略,并对近年来相关领域...     

羊毛硫肽SapB类多肽促进链霉菌形态分化作用的研究

【目的】链霉菌属于革兰氏阳性菌,以复杂的形态分化过程和强大的次级代谢产物合成能力为主要特征。链霉菌的形态分化与次级代谢产物的产生密切相关。Ⅲ型羊毛硫肽SapB能够促进天蓝色链霉菌气生菌丝体形成,暗示这类多肽可以作为靶标用于形态分化改造工程开发。本研究表征了SapB类多肽对多种链霉菌形态分化的影响,为该类多肽的工程化应用提供理论基础。【方法】生物信息学分析多个链霉菌基因组中SapB类多肽的生物合成基因簇,构建SapB类多肽的异源表达载体,利用接合转移方法导入不同链霉菌中进行异源表达,探究SapB类多肽对链霉菌形态分化的影响。【结果】SapB类多肽在不同程度上促进了多个链霉菌由营养菌丝向气生菌丝分化,表现为气生菌丝体数量的增多和分化速度的加快,缩短了链霉菌形态分化周期。【结论】SapB类多肽的过表达有助于缩短链霉菌形态分化周期,可用于针对链霉菌形态分化的工程改造。     

醌那霉素生物合成中间产物的一锅酶促体系研究

【目的】 通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】 纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一锅酶法进行体外反应,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测反应产物;利用该体系探究Ⅱ型硫酯酶AlpS在合成通路中的功能及作用底物;利用单一变量法对体系温度、pH、最小聚酮合酶(minimal polyketide synthase, minimal PKS)浓度和Ⅱ型硫酯酶AlpS浓度等条件进行优化。【结果】 体系所需的聚酮合酶和辅助蛋白均获得可溶性表达;利用一锅酶法成功合成了醌那霉素的早期重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin;加入AlpS蛋白后以上5种产物产量均有不同程度的提高,其中prejadomycin和dehydrorabelomycin提高较为显著;优化后的反应最适条件为:温度30℃、pH 7.0、最小聚酮合酶(AlpA、AlpB和RavC)浓度各2.8 μmol/L、AlpS 7.2 μmol/L;prejadomycin的产量提高到302 mg/L。【结论】 本研究成功利用一锅酶法在无细胞条件下重构了醌那霉素的早期生物合成途径,合成了醌那霉素的重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin。研究进一步验证了硫酯酶AlpS的链释放功能并推测其作用底物。     

友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。     

棒状链霉菌中隐性羊毛硫肽CLA 124的半体外生物合成

摘要:【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽,为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统,在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后,体外酶切反应切除前导肽,利用MALDITOFMS检测核心肽的脱水情况,并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124,其核心肽脱去了4分子水,并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。     

非核糖体肽合成酶(NRPSs)作用机理与应用的研究进展

许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。NRPSs由多个模块组成,模块的不同空间排列顺序决定其多肽产物的氨基酸序列特异性。NRPSs以多载体巯基化模板机理进行多肽合成,其底物特异性由腺苷酰化结构域和缩合结构域共同实现。目前,人们已经利用天然的NRPSs、某些特定结构域、将已知NRPSs的模块或特定结构域进行组合甚至杂合组合而构建成的新的NRPSs来合成目的多肽。     

不吸水链霉菌ZB01 cyp107z基因的克隆及原核表达纯化

【目的】克隆不吸水链霉菌ZB01中的cyp107z基因,在E.coli中异源表达纯化,测定重组酶蛋白的酶动力学参数,为该基因的进一步研究奠定基础。【方法】根据cyp基因保守区序列设计引物,扩增不吸水链霉菌ZB01基因组中cyp107z基因的部分序列,通过染色体步移技术获取全长基因。利用pET28a表达载体构建该基因原核表达载体并于E.coli中诱导表达,以Ni-NTA亲和层析纯化表达出的重组蛋白。以阿维菌素为底物,构建重组蛋白体外催化体系,通过测定体系中NADPH的消耗,计算重组蛋白催化阿维菌素反应的酶动力学参数。【结果】从不吸水链霉菌ZB01基因组扩增出一条cyp107z基因同源基因,全长1290 bp,编码429个氨基酸残基,命名为cyp107z13,在E.coli中诱导表达了该重组酶蛋白,纯化后的重组酶蛋白催化阿维菌素的Km值为1.4μmol/L,Vmax为0.041μmol/min.mg,kcat为0.033 s-1。【结论】从不吸水链霉菌ZB01中克隆到cyp107z13基因,异源表达的CYP107Z13重组蛋白能够催化以阿维菌素为底物的氧化反应。