结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白ESAT-6增强巨噬细胞吞噬功能

【目的】研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)分泌蛋白ESAT-6(early secreted antigenictarget of 6 kDa)对巨噬细胞吞噬功能的影响。【方法】用重组质粒pFLAG-ESAT-6和pFLAG-EGFP转染RAW264.7细胞,经G418筛选,PCR、RT-PCR和Western blot鉴定,获得稳定表达flag-ESAT-6和flag-EGFP的RAW细胞系,然后用流式细胞术观察各稳转细胞系吞噬荧光微球的能力,并用共聚焦显微镜和菌落计数法检测稳转细胞系吞噬大肠杆菌(Escherichia coli)的能力。【结果】获得了稳定表达flag-ESAT-6的RAW-E6细胞系和表达flag-EGFP的RAW-EGFP细胞系;流式细胞术检测结果表明RAW-E6吞噬荧光微球的能力显著强于野生型细胞系RAW264.7和对照细胞系RAW-EGFP;菌落计数和激光共聚焦分析表明RAW-E6细胞系吞噬E.coli的能力也显著强于RAW264.7和RAW-EGFP。【结论】通过胞内表达发现结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6能够增强巨噬细胞的吞噬功能,这将为深入理解结核分枝杆菌的致病机制提供新的思路。     

结核分枝杆菌对巨噬细胞抗原呈递功能的抑制作用

本文旨在通过观察结核分枝杆菌刺激后巨噬细胞抗原呈递功能的变化, 探讨结核分枝杆菌的免疫逃逸机制。在体外, 结核分枝杆菌刺激巨噬细胞24 h 后, 用流式细胞仪检测γ干扰素( IFN-γ) 诱导的主要组织相容性复合物( MHC) Ⅱ类分子、CD86 和CD80 的表达变化; 酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测巨噬细胞的抗原呈递功能; 反转录-聚合酶链反应检测巨噬细胞CⅡTA 及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA 水平。结果发现, 结核分枝杆菌抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞表面MHCⅡ 类分子和CD86 的表达, 且呈剂量依赖性, 但CD80的表达变化不明显; 抗原呈递功能明显降低; 结核分枝杆菌刺激后巨细胞CⅡTA 及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ的mRNA 水平显著降低。提示结核分枝杆菌可能通过降低CⅡTA 及其启动子PⅠ、PⅢ和PⅣ 的mRNA 水平, 抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达; 结核分枝杆菌可降低巨噬细胞CD86 的表达, 抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞抗原呈递功能。     

结核分枝杆菌HspX蛋白的原核高效可溶性表达及产物抗原性分析

目的:利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌HspX蛋白并进行纯化,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增HspX核酸序列,克隆至原核表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western印迹初步评价HspX的抗原性。结果:经IPTG诱导,HspX蛋白在原核系统内获得了可溶性表达,经镍柱亲和层析获得了纯度达95%以上的重组蛋白。Western印迹结果证明重组HspX蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论:重组蛋白HspX在大肠杆菌中以可溶性形式表达,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

目的研究结核分枝杆菌（MTB）ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白,通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白,以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因（atg）分子水平和蛋白表达水平。结果ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成,并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降最为明显。结论MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。     

结核分枝杆菌Rv3425蛋白的原核表达纯化及其血清学诊断价值

目的：用原核系统表达结核分枝杆菌Rv3425蛋白并纯化,评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法：以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板,PCR扩增得到Rv3425基因序列,克隆至表达载体pET-28a中,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导、表达后纯化,用Western印迹和ELISA法进行抗原性初步评价。结果：在原核系统内经IPTG诱导表达后,Rv3425蛋白主要以包涵体形式存在,经复性和镍柱层析纯化后,纯度达95%以上;Western印迹和ELISA结果证明重组Rv3425具有较强的抗原活性;用纯化的Rv3425蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达50%。结论：高纯度的Rv3425蛋白在结核病诊断方面具有很高的应用价值,可作为结核病诊断的备选抗原。     

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

结核分枝杆菌感染对人巨噬细胞离子通道及其调控元件转录表达的影响

为研究人巨噬细胞的离子通道及其调控元件是否参与了抗结核分枝杆菌感染免疫,利用表达谱芯片技术研究细菌感染后主巨噬细胞基因的表达情况,在全局表达谱分析的基础上,重点分析了离子通道及其调控元件的表达,并比较无毒株和临床分离有毒株在诱导离子通道及其调控元件表达方面的差异。结果表明,细菌感染影响离子通道及其调控元件基因的表达,涉及的离子通道包括钾通道、钠通道、氯通道、钙通道,差异表达的调控元件包括G蛋白、G蛋白偶联受体、蛋白质激酶和磷酸化酶;临床株感染影响的离子通道及其调控元件较无毒株广泛和丰富。这些观察结果提示,离子通道及其调控元件参与了宿主细胞对感染细菌的免疫应答,有关离子通道及其调控元件在抗结核免疫中的作用有待进一步研究。芯片研究的结果为将来的研究提供了线索。     

结核分枝杆菌Rv1057基因对巨噬细胞感染早期细胞因子表达的影响分析

Rv1057是结核分枝杆菌中唯一的7-折叠片β-螺旋蛋白,其生物学功能尚不清楚。为探讨Rv1057基因在结核分枝杆菌感染初期对巨噬细胞免疫应答的影响,利用Rv1057基因缺失菌株D1057和野生型H37Rv菌株感染巨噬细胞,检测结核分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖速度,分析巨噬细胞在感染初期的细胞因子表达量变化。研究结果表明:D1057菌株在巨噬细胞内的活菌数量和增殖速度都显著低于H37Rv,被D1057感染的巨噬细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ表达量显著降低,但IL-8大量表达且无显著差异。上述研究结果证实,缺失Rv1057会降低结核分枝杆菌刺激巨噬细胞产生某些细胞因子的能力,明确了Rv1057基因参与结核分枝杆菌与巨噬细胞之间的免疫应答,为进一步解析Rv1057基因的生物学功能、结核分枝杆菌的致病机制奠定了基础。     

PPARγ对结核分枝杆菌脂蛋白P19诱导的巨噬细胞炎症反应的影响

目的:探讨PPARγ对结核分枝杆菌细胞壁成分19 kDa脂蛋白(M.tb-P19)诱导的巨噬细胞免疫反应的影响。方法:以M.tb H37Rv和M.tb-P19刺激人源性巨噬细胞48 h,观察其对巨噬细胞PPARγ表达的影响。分别采用激动剂、拮抗剂干预PPARγ活性,观察PPARγ被激活或抑制后对M.tb-P19诱导的ERK磷酸化、NF-κB的表达以及炎症细胞因子IL-6、TNF-α的表达的影响。结果:M.tb-P19感染的人巨噬细胞中PPARγ的表达较正常对照细胞显著升高,且随作用时间的延长逐渐增加(P0.05),48h达高峰。M.tb-P19感染可显著增加人巨噬细胞中磷酸化ERK、NF-κB、TNF-α和IL-6的表达(P0.05),PPARγ激动剂预处理可显著抑制M.tb-P19感染所致的磷酸化ERK、NF-κB、TNF-α和IL-6的表达增加(P0.05),而PPARγ拮抗剂预处理可进一步提高磷酸化ERK、NF-κB、TNF-α和IL-6的表达(P0.05)。结论:PPARγ可能是通过激活ERK及NF-κB信号通路,抑制M.tb-P19所介导的巨噬细胞炎症反应。     

结核分枝杆菌GroEL1蛋白过表达的生理效应分析

为研究结核分枝杆菌热休克蛋白GroEL1在耻垢分枝杆菌中过表达所引发的生理效应,本实验采用透射电子显微镜观察细菌个体形态,并绘制细菌群体生长曲线;药敏试验检测重组耻垢分枝杆菌的药物耐受性;细菌攻毒BALB/c小鼠以检测细菌在体内的存活能力;通过病理切片观察细菌毒力。结果显示,GroEL过表达细菌菌体内核糖体数量显著增加,细菌生长分裂能力及群体适应能力提高,但对常用的一线、二线抗结核药物耐受性无影响。GroEL1过表达有助于延长细菌在宿主体内的生存周期,增强细菌毒力。结果提示,结核分枝杆菌GroEL1蛋白过表达会对细菌体内、体外生长产生明显影响。     

结核分枝杆菌RD-1区编码蛋白的结构和功能

RD-1(region of difference-1)被认为在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的致病机理中起着关键的作用．RD-1基因全长9.5 kb,开放读码框从Rv3871～Rv3879c,分别编码9种不同的蛋白质．RD-1区在卡介苗(bacillus Calmette-Guerin,BCG)中是缺失的．研究结果显示,RD-1区是结核分枝杆菌的主要毒力因素之一,同时RD-1区参与了一种新的分泌系统ESX-1,这种分泌系统能够促进某些特定蛋白的分泌．ESX-1分泌的两种主要蛋白质CFP-10 (culture filtrate protein of 10 ku)和ESAT-6 (early secreted antigenic target of 6 ku)能够形成牢固的1∶1的复合体,这两种蛋白质能够协同分泌而且能够引起T细胞反应,并可能作为理想的靶抗原在结核的预防和诊断中发挥作用．     

鸟分枝杆菌PPE25蛋白对THP-1巨噬细胞免疫效应的影响

[目的]探讨鸟分枝杆菌PPE25在调控人源THP-1巨噬细胞免疫应答反应中的作用及机制.[方法]通过基因扩增、载体构建、诱导表达、分离纯化等过程制备鸟分枝杆菌重组PPE25蛋白;将重组PPE25蛋白作用于THP-1巨噬细胞后,利用流式细胞术检测巨噬细胞凋亡率;运用ELISA方法检测细胞上清中TNF-α的浓度;采取Wes...     

结核分枝杆菌esat6-rpfD融合基因的原核表达及产物纯化

目的：构建结核分枝杆菌融合基因esat6-rpfD的原核表达载体,表达和纯化ESAT6-RpfD融合蛋白。方法：从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中经PCR分别扩增esat6和慢周基因,克隆入pMD19-T载体,测序后克隆入原核表达载体pProExHTB,酶切重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。结果：PCR扩增的esat6、rpfD基因序列与GenBank报道一致;诱导表达后,经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约30000处有目的条带,融合蛋白以包涵体形式表达。结论：构建了esat6-rpfD融合基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达并纯化得到ESAT6-RpfD融合蛋白。     

绵羊GM-CSF原核表达及蛋白功能检测

目的:构建GM-CSF原核表达载体,并诱导表达、纯化其蛋白.方法:将GM-CSF基因克隆至原核表达载体pET-32中,转化至BL21中,用智能蛋白质多维纯化系统(AKTAxpressTM)纯化目的蛋白,利用MTT法测定GM-CSF融合蛋白对绵羊外周血淋巴细胞的增殖活性.结果:成功获得了435bp的绵羊GM-CSF基因片段,诱导表达了35kDa融合蛋白GM-CSF,其纯度达95％以上,浓度达860mg/mL;通过MTT证明该融合蛋白对绵羊淋巴细胞具有增殖活性,其作用最明显的蛋白浓度是200μg/mL.结论:成功获得重组蛋白GM-CSF,该蛋白具有较好的生物活性,为免疫增强佐剂的开发奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1884c基因的克隆及其原核表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rv1884c基因的表达蛋白。方法:制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX-4T-1构建质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH5α,再经IPTG诱导表达GST-1884融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的相对分子质量及表达形式。结果:扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c,转化大肠杆菌DH5α后经诱导产生了高水平的表达产物。结论:构建了pGEX-4T-1-Rv1884c质粒载体,并诱导表达了GST-1884融合蛋白,为进一步研究Rv1884c蛋白的活性及其功能,探讨结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达

抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。     

结核分枝杆菌RPF样蛋白家族及其功能

上世纪末,Mukamolova等从藤黄微球菌（Micrococcus luteus）发现一种分泌蛋白-复苏促进因子（Rpf）.该因子在皮摩尔浓度下能促进休眠期的藤黄微球菌及其他数种高G＋C含量的革兰氏阳性菌复苏和生长.结核分枝杆菌全基因组发现和该因子同源性较高的5个基因,预测产物都是分泌蛋白,一级结构都含有一个转糖基域.5个基因有一个共同的功能未知的域,3级结构预测该保守结构域和溶菌酶同源.重组表达的Rpf对不同种均有活性.5个rpf在不同生长时期均有表达,但调控有差异.     

结核分枝杆菌对宿主巨噬细胞死亡方式的调控

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染后能抑制宿主巨噬细胞（M西）的免疫反应,并在其中生存、复制。研究表明Mtb减毒株感染主要诱导宿主Mφ凋亡,凋亡能抑制胞内Mtb的活力;而Mtb毒力株感染能抑制凋亡的完成,诱导Mφ坏死,最终导致Mtb扩散、感染临近细胞。通过对Mtb感染诱导宿主Mφ不同死亡方式的讨论,进一步认识Mtb的致病机制。     

巨噬细胞凋亡对结核分枝杆菌感染的机制研究进展

结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染性疾病,主要由结核分枝杆菌感染导致,结核分枝杆菌进入人体后,与免疫防御的第一道屏障—巨噬细胞发生反应,部分菌株在细胞内长期生存、繁殖,是导致结核病转归的决定性因素。感染早期,结核分枝杆菌的繁殖受到巨噬细胞凋亡的抑制,随着高效价、高毒力菌株繁殖速度的增加,抗巨噬细胞凋亡作用不断增强,使自身繁殖得到有效保护,为菌株的生长提供了充足、适宜的胞内环境。因此,调控结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡进程的抑制作用,是预防和治疗结核病的关键。     

结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究进展

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）是一种典型的胞内致病菌,巨噬细胞是MTB在体内的主要宿主细胞。巨噬细胞具有强大的吞噬功能,在机体固有免疫和适应性免疫中均发挥着重要作用,可有效保护宿主免受结核分枝杆菌的感染。MTB在与宿主巨噬细胞的长期相互作用过程中,逐渐形成多种逃避杀灭的有效策略,得以在宿主体内存活并增殖。该文从巨噬细胞抗MTB感染及MTB逃避巨噬细胞杀灭两个方面综述国内外的研究进展。