点蜂缘蝽触角转录组及化学感受相关基因的分析

【目的】点蜂缘蝽Riptortus pedestris主要为害豆科作物,成虫和若虫刺吸汁液,造成严重损失,目前对该虫的研究较少,基因信息缺乏。本研究旨在获得点蜂缘蝽的触角转录组数据,开发基于嗅觉防治害虫的新方法。【方法】利用Illumina Hi SeqTM4000高通量测序技术测定了点蜂缘蝽成虫触角转录组,并进行了生物学信息分析。【结果】共获得45 802 812条clean reads,包括6.87 Gb(Gen Bank登录号:SRR4429103)。拼接92 259条unigenes,平均长度为618 bp,N50为1 013 bp。在7大数据库中注释到21 365条unigenes。通过进一步转录组数据分析,我们鉴定出219个点蜂缘蝽化学感受相关基因,包括188个嗅觉受体、6个味觉受体、2个离子型受体、4个感觉神经元膜蛋白、8个气味结合蛋白和11个化学感受蛋白。氨基酸序列分析发现,RpedOBP1和RpedOBP2在第6个保守的半胱氨酸后又多了3个保守的半胱氨酸位点,属于加Plus-C气味结合蛋白家族。【结论】本研究获得了点蜂缘蝽触角转录组数据,并鉴定出嗅觉相关基因,结果为今后利用嗅觉基因靶标防治点蜂缘蝽提供了重要的分子生物学信息数据。     

褐飞虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究

表皮蛋白与几丁质结合构成抵御外界不良环境的昆虫角质层, 在昆虫的生长发育及蜕皮硬化中具有重要的作用。为了探讨表皮蛋白基因在褐飞虱Nilaparvata lugens生长发育中的功能, 本研究根据褐飞虱转录组测序信息, 对其中1个预测为编码表皮蛋白的Unigene36450序列进行了克隆, 并应用荧光定量PCR和RNA干扰（RNAi）技术分别对该基因的表达规律和功能进行了研究。结果表明： 克隆的 Unigene36450全长cDNA开放阅读框长585 bp, 编码的蛋白含194个氨基酸, 具有典型的表皮蛋白R&R保守结构域, 命名为NlICP。转录水平的时序表达分析发现, NlICP仅在褐飞虱若虫期表达, 且在3龄若虫体内表达量最高, 提示该基因编码的蛋白属于幼虫表皮蛋白。RNA干扰结果显示, 取食dsNlICP的1龄末2龄初（孵化后第3 天）若虫在干扰6 d和8 d时, NlICP基因的表达量分别较取食dsGFP的对照组下降58.8%和45.6%, 差异极显著(P<0.01); 干扰后部分褐飞虱若虫因蜕皮不完全死亡, 干扰5 d的存活率较对照下降26.7%。本研究结果提示, NlICP与褐飞虱若虫的生长发育及蜕皮相关, 可以作为褐飞虱防治的潜在靶标基因。     

棉铃虫漆酶2基因的分子鉴定

【目的】黑化反应在昆虫表皮骨化以及免疫防御过程中起着重要作用, 酚氧化酶是黑化反应中的关键酶类, 漆酶2 (laccase2, LAC2)是酚氧化酶的一种, 在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要的作用。本研究旨在探讨LAC2在棉铃虫Helicoverpa armigera表皮骨化中表达模式及激素调控作用。 【方法】采用PCR及RACE的方法, 从棉铃虫5龄幼虫中得到了lac2 cDNA全序列。利用荧光定量PCR、 激素处理及RNA干扰方法, 对LAC2的表达模式差异和激素调控作用进行分析。【结果】序列分析表明, lac2 cDNA全长3 221 bp, 编码框长度为2 268 bp, 编码756个氨基酸残基。发育时序表达分析发现, lac2在幼虫各龄期表达规律相似, 均在蜕皮期高水平表达, 在5龄96 h转录水平达到最高峰。组织表达结果分析, lac2基因在幼虫表皮和成虫卵巢以及触角表达量较高。激素处理实验发现, 保幼激素类似物（methoprene）对lac2基因转录有抑制作用; 蜕皮激素（20-hydroxyecdysone）则促进其表达。进一步利用RNA干扰蜕皮激素受体EcR （ecdysone receptor）和USP （ultraspiracle isoform）基因发现, 干扰后蜕皮激素受体的表达明显受到抑制, 同时lac2基因的表达也显著受到抑制, 表明蜕皮激素调控lac2基因转录。【结论】这些结果为进一步研究漆酶在昆虫表皮的骨化以及免疫防御等方面不同的生理功能提供理论依据。     

飞蝗Knickkopf家族基因表达对蜕皮激素的响应

【目的】研究飞蝗LocustamigratoriaKnickkopf(Knk)家族基因mRNA表达对蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）的响应情况,丰富飞蝗Knk家族基因功能研究,为飞蝗表皮发育相关基因的转录调控研究奠定基础。【方法】采用RT-qPCR方法,对LmKnk家族4个基因在飞蝗不同发育天数（5龄若虫第1天到成虫第3天）的表皮中的表达特性进行分析;向飞蝗体腔注射20E,分析LmKnk家族4个基因表达的变化情况;采用RNAi技术干扰20E受体基因LmEcR,分析LmKnk家族基因的表达变化情况。【结果】通过RT-qPCR检测,发现LmKnk在飞蝗5龄第1天至成虫第3天不同发育天数的表皮中均衡表达,而LmKnk2,LmKnk3-FL及LmKnk3-5'基因均在蜕皮前表达量逐渐升高,蜕皮后迅速降低。向飞蝗体腔注射20E后,发现飞蝗Knickkopf家族4个基因对20E均有应答,但响应时间点有差异,LmKnk和LmKnk2的表达量分别在注射20E 3 h和6 h后开始升高,而LmKnk3-FL和LmKnk3-5'的表达量在注射20E12h后开始上升。飞蝗5龄第1天若虫注射ds LmEcR后,发现Knickkopf家族4个基因表达均下调。【结论】飞蝗Knickkopf家族基因的表达受20E调控,是20E的下游应答基因。     

Met和Kr-h1基因在褐飞虱变态发育中的功能分析

【目的】保幼激素受体Methoprene-tolerant(Met)控制保幼激素信号传导途径中重要下游转录因子Krüppelhomolog 1(Kr-h1)的表达,调控昆虫的变态发育。本研究旨在探究褐飞虱Nilaparvata lugens Met基因与Kr-h1在褐飞虱变态发育中的功能。【方法】利用PCR技术扩增Nl Met基因的ORF序列。通过RNA干扰技术分别或同时沉默褐飞虱若虫的Nl Met和Nl Kr-h1基因,进一步研究其功能。【结果】克隆得到Nl Met,其开放阅读框包含1 185 bp,编码395个氨基酸,包括b HLH,PAS-A,PAS-B和PAC 4个结构域;其中PAS-B和PAC保守性较高,而b HLH和PAS-A保守性相对较低。采用RNA干扰技术沉默Nl Met和Nl Kr-h1基因后发现,单独对4龄若虫Nl Kr-h1基因干扰后,若虫阶段及初羽化雌虫和雄虫死亡率均显著上升(P0.05);对5龄若虫Nl Kr-h1基因干扰后只有若虫死亡率上升(P0.05),单独对Nl Met基因干扰后死亡率没有显著变化(P0.05);二者共同沉默后的死亡率同单独对Nl Kr-h1沉默时类似。此外,我们还发现单独对4龄若虫Nl Kr-h1干扰后在雌虫中出现了生殖器畸形,虽然Nl Met干扰并未出现生殖器发育畸形现象,但二者共同干扰后,在若虫、初羽化雌雄成虫中畸形比例均显著增加(P0.05)。【结论】Nl Met与下游转录因子Nl Kr-h1对褐飞虱变态发育起到重要作用,影响若虫到成虫的变态和外生殖器的发育。本研究有助于揭示Nl Met和Nl Kr-h1在昆虫变态发育中的重要作用。     

家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达

【目的】维生素B₆在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶,维持氨基酸代谢的正常运行。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5′-phosphate, PLP）是维生素B₆的主要辅酶形式,吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）是PLP的重要生成酶,本研究试图明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系。【方法】本研究采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）方法对家蚕 Bombyx mori 的PLK基因进行干扰,通过体外合成PLK基因的3个干扰片段（siRNA1, siRNA2和siRNA3）,将siRNA从体腔注入5龄第3天的家蚕幼虫体内诱导RNAi。利用荧光定量PCR测定不同干扰片段、不同时间点及不同组织中PLK基因表达量的变化;并测定家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶（phosphoserine aminotransferase, SerB）和天门冬氨酸氨基转移酶（asparate aminotransferase, AST）基因的表达量。【结果】注射干扰片段后48 h干扰效果达到最佳。3个干扰片段干扰效果从高到低依次为siRNA1, siRNA2和siRNA3。RNAi效果最好的是中肠组织,其PLK基因的相对表达量下降了55%。RNA干扰PLK基因后,后部丝腺中SerB和AST基因相对表达量分别下降了90%和29%。【结论】本研究通过RNAi实现了家蚕PLK基因干扰,并进一步证明了家蚕PLK基因和SerB基因及AST基因存在联动调节关系。     

Q型烟粉虱UDP-糖基转移酶UGT354A1基因克隆及其在噻虫嗪抗性中的作用

【目的】UDP-糖基转移酶（UGTs）是昆虫主要的Ⅱ期解毒酶,可能参与昆虫抗药性的形成。本研究旨在探究Q型烟粉虱中UGT基因是否参与其对噻虫嗪的抗药性。【方法】依据烟粉虱基因组数据库设计引物,克隆其UGT354A1基因的全长序列;采用qRT-PCR技术检测UGT354A1基因在烟粉虱不同发育阶段、不同组织部位以及抗敏品系中的表达量;通过RNA干扰试验,验证UGT354A1基因在烟粉虱噻虫嗪抗性中的作用。【结果】序列生物信息学分析发现,UGT354A1基因属于典型的昆虫UGTs,包括两个糖基供体（DBR1和DBR2）和一个保守特征性基序。qRT-PCR结果显示,UGT354A1基因在噻虫嗪抗性品系（THQR）中的表达量为敏感品系（THQS）的2.60倍,且噻虫嗪可显著诱导该基因的表达。在不同发育阶段和组织部位中,发现UGT354A1基因在烟粉虱若虫和成虫阶段及头部和胸部表达丰富。RNAi后,沉默UGT354A1基因能够显著增加噻虫嗪对Q型烟粉虱的毒杀作用。【结论】UGT354A1基因在Q型烟粉虱中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,可能参与了抗性的形成。     

飞蝗细胞色素P450基因LmCYP6FD3的表达及其在杀虫剂解毒中的作用

【目的】研究飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因的分子特性和生物学功能。【方法】搜索飞蝗转录组数据库,获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA全长序列。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定其在飞蝗5龄若虫不同组织(胃盲囊、前肠、中肠、后肠、体壁、精巢、卵巢、肌肉、血淋巴、脂肪体和马氏管)中及不同发育阶段(卵、1-5龄若虫及成虫)的表达水平。采用RNA干扰(RNAi)技术沉默飞蝗2龄若虫细胞色素P450基因,检测基因的沉默效率,并研究该基因干扰后,2龄若虫对杀虫剂马拉硫磷、西维因和溴氰菊酯3种杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KT316378),将其命名为LmCYP6FD3,其核苷酸序列全长为1 563 bp,编码521个氨基酸。研究发现该基因在飞蝗5龄若虫马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体中,在其他组织中的表达量相对较低;对LmCYP6FD3在飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现该基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫期表达量较高。RNA干扰结合杀虫剂生物测定结果表明,LmCYP6FD3在RNA干扰24 h时的沉默效率最高;2龄若虫点滴接触西维因,RNAi处理组(dsLmCYP6FD3注射组)与对照组(ds GFP注射组)相比,死亡率提高了32%。【结论】克隆获得飞蝗LmCYP6FD3的cDNA全长序列,该基因在飞蝗马氏管中高表达,并可能参与西维因在飞蝗体内的解毒代谢。     

温度胁迫下棉花粉蚧热激蛋白基因的表达分析

【目的】为了研究热激蛋白 Hsp70, Hsp70-4和Hsp90在棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis抵抗逆温中的作用。【方法】在测序棉花粉蚧转录组的基础上,分析了该虫热激蛋白Hsp70基因家族的2个序列［Pshsp70（GenBank登录号为KJ909505）和Pshsp70-4（GenBank登录号为KJ909506）］和Hsp90基因家族的1个序列,［Pshsp90(GenBank登录号为KJ909507)］,采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测了在不同温度（18和32℃恒温, 37, 39, 41, 43和45℃热激1 h 后26℃恢复1 h)下棉花粉蚧不同发育阶段（2龄若虫、3龄若虫、雌成虫）3种热激蛋白基因的表达量。【结果】Pshsp70 cDNA序列包含1 923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,理论分子量和等电点分别为70.9 kDa和5.65; Pshsp70-4 cDNA序列包含1 962 bp的开放阅读框,编码654个氨基酸,理论分子量和等电点分别为71.8 kDa和5.38;Pshsp90 cDNA序列包含2 172 bp的开放阅读框,编码724个氨基酸,理论分子量和等电点分别为83.5 kDa和4.93。Pshsp70 和Pshsp70-4均含有Hsp70基因家族高度保守的基序,Pshsp70编码的氨基酸序列与烟粉虱Bemisia tabaci和家蚕Bombyx mori等昆虫的Hsp70 的氨基酸序列一致性为 85%;Pshsp70-4编码的氨基酸序列与白蜡蚧Ericerus pela和点蜂缘蝽Riptortus pedestris等昆虫的Hsp70的氨基酸序列一致性高达95%;Pshsp90也含有Hsp90基因家族高度保守的基序,Pshsp90编码的氨基酸序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum和东亚小花蝽Orius sauteri等昆虫的Hsp90 的氨基酸序列一致性为 87%。热激蛋白基因表达量分析结果表明,在18℃恒温条件下,粉蚧2龄若虫的3个PsHsps基因的mRNA相对表达量均比对照(26℃)低,在32℃恒温条件下,各龄期的Hsp70基因的相对表达量均显著高于对照。在37~45℃下热激1 h并在26℃下恢复1 h,棉花粉蚧3个龄期的3个热激蛋白PsHsps基因的相对表达量随温度的升高总体呈增加趋势,相关性分析表明,除Pshsp70-4在雌成虫中的表达量与热胁迫温度的相关系数为0.225外,各龄期中3个基因的表达量与温度的相关系数均大于0.6,显著相关;43℃和45℃胁迫下,各龄期的3个热激蛋白基因相对表达量均显著高于对照组（P<0.05）。【结论】棉花粉蚧热激蛋白基因的表达与温度呈正相关,在该虫应对高温中起着重要作用。