肠道病毒71型逃逸宿主固有免疫的分子机制

肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV-A71)感染常引起婴幼儿手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD),严重者可伴有中枢神经系统并发症。近年来,EV-A71引起的手足口病已成为我国以及亚太地区迫切需要解决的公共卫生问题。目前,EV-A71的致病机制并不清楚,但逃逸宿主免疫应答被认为是其重要的致病机理之一。现主要就EV-A71逃逸宿主固有免疫的分子机制做一综述,概述近年来有关EV-A71如何利用其自身编码的2A pro、3C pro等非结构蛋白,影响宿主对病毒核酸的识别、IFN诱发生成及IFN信号通路的激活,从而逃逸宿主固有免疫的主要进展情况,并对抗病毒感染免疫治疗策略作简略讨论。     

MEK1/2抑制剂U0126抑制肠道病毒71型的复制

为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础.     

白藜芦醇通过下调MEK/ERK/c-Jun信号通路抑制H2O2诱导的肺癌细胞增殖

目的:探讨白藜芦醇(Res)是否通过下调ERK激酶/胞外信号调节激酶/原癌基因(MEK/ERK/c-Jun)信号通路抑制小剂量过氧化氢(H2O2)诱导肺癌细胞增殖。方法:采用MTS实验检测小剂量20μM H2O2以及分别加入MEK阻断剂U0126和Res后H2O2对肺癌细胞NCI-H1395增殖的影响,采用Western Blot检测H2O2对ERK1/2和Akt蛋白磷酸化水平以及加入Res后H2O2对MEK、ERK1/2和c-Jun蛋白磷酸化水平的影响。结果:小剂量H2O2对肺癌细胞NCI-H1395具有促增殖作用,H2O2通过活化ERK1/2和Akt蛋白的磷酸化水平促进肺癌细胞NCI-H1395增殖,加入MEK阻断剂U0126后H2O2对肺癌细胞NCI-H1395增殖作用降低(P<0.05)。Res可抑制H2O2诱导的肺癌细胞NCI-H1395增殖,加入Res后,H2O2引起的MEK、ERK1/2和c-Jun蛋白磷酸化水平均降低(P<0.05)。结论:小剂量H2O2对肺癌细胞NCI-H1395具有促增殖作用,Res通过抑制MEK/ERK/c-Jun信号通路来抑制H2O2对肺癌细胞NCI-H1395的促增殖作用,其具体机制还需进一步研究。     

雌激素受体α36参与淫羊藿素对MG63细胞的促增殖和抗凋亡作用

淫羊藿素能够显著改善绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis, PMOP),其作用机制尚未阐明。本研究旨在探讨雌激素受体α36 (estrogen receptorα36, ERα36)在淫羊藿素对成骨细胞促增殖和抗凋亡中的作用及其下游信号转导机制。通过转染shRNA载体构建ERα36敲减的人成骨肉瘤MG63细胞模型,用CCK-8检测细胞增殖情况,用流式细胞术检测细胞凋亡,用Western blot检测细胞内ERK和AKT信号通路的激活情况。结果显示,ERα36敲减后,淫羊藿素对MG63细胞的促增殖和抗凋亡作用显著减弱;淫羊藿素可上调MG63细胞内ERK及AKT磷酸化水平,该作用可被ERα36敲减取消;U0126 (ERK信号通路阻断剂)和LY294002 (AKT信号通路阻断剂)分别预处理后,淫羊藿素对MG63细胞的促增殖作用均显著减弱;U0126预处理后,淫羊藿素对MG63细胞的抗凋亡作用显著减弱;而给予LY294002预处理后,淫羊藿素对MG63细胞的抗凋亡作用无明显变化。以上结果提示,淫羊藿素通过ERα36及其下游的ERK及AKT信号通路发挥了对成骨细胞的促增殖和抗凋亡作用。     

IQGAP1通过ERK信号通路促进非小细胞肺癌细胞增殖

该研究探讨了IQGAP1(IQ domain GTPase-activating protein 1)对非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)细胞增殖的影响及其对ERK信号通路的调节作用。将内源性IQGAP1低表达的A549细胞中分为空白组、空载组和IQGAP1过表达组;将内源性IQGAP1高表达的H1299细胞中分为空白组、阴性对照si RNA组和IQGAP1 si RNA组;采用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126处理上述两株细胞。MTT法检测细胞增殖能力,Western blot法检测ERK1/2和p-ERK1/2蛋白质水平。结果显示,在A549细胞中,过表达IQGAP1能促进细胞增殖并促进ERK1/2磷酸化;在H1299中,敲低IQGAP1表达能够抑制细胞增殖并下调ERK1/2磷酸化水平。用U0126处理后能抑制IQGAP1对细胞增殖的促进作用。研究结果表明,IQGAP1可通过ERK信号通路促进体外非小细胞肺癌细胞增殖。     

EV-A71和CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞诱导差异性IFN-I产生通路相关基因表达的研究

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种全球性的传染病,其主要病原体为肠道病毒A组71型(Enterovirus group A 71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(cosackievirus A 16,CV-A16)。EV-A71感染易引发重症病例及死亡病例,而CV-A16感染所致的症状普遍较轻,且CV-A16容易引发重复感染,但目前其中的机理仍不清楚。本研究比较了EV-A71与CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞16HBE后I型干扰素(Type I interferon,IFN-Ι)产生相关基因的改变。结果发现EV-A71感染后TLR3、TLR7、RIG-I、MDA5、MAVS、MyD88、IRF3、IRF7、IFNα和IFNβ的基因表达量均发生了显著性地上调,而在CV-A16感染后仅MDA5显著性上调;TLR3和IRF3的基因表达水平显著性地下降,而其它基因表达水平均无显著性地变化。此外,病毒滴度和病毒拷贝数的检测结果显示,CV-A16在16HBE上的复制效率明显高于EV-A71。上述结果提示我们EV-A71和CV-A16感染16HBE对其IFN-I产生相关基因表达的影响完全不一样,且CV-A16更容易感染人呼吸道上皮细胞。本研究为EV-A71和CV-A16引起的临床症状差异的机理研究以及CV-A16重复感染的机理研究提供了线索。     

基于反向遗传学技术获取具有精确末端的EV-A71

目的基于反向遗传学技术,设计可获取具有精确末端的肠道病毒A71(enterovirus A71, EV-A71)的方法,并在病毒感染能力研究和抗病毒药物筛选中进行应用。方法利用同源重组方法,在病毒基因组5′末端,引入具有顺式酶切活性的锤头状核酶(cis-active hammerhead ribozyme)序列;在病毒3′末端的poly(A)尾后,引入限制性核酸内切酶NsiⅠ酶切位点(ATGCA↓T),构建含有EV-A71全长感染性克隆的质粒(pBR322-EV-A71)。pBR322-EV-A71经体外转录获得EV-A71感染性RNA,用该RNA转染横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyo-sarcoma cells, RD),以获取具有精确末端的EV-A71颗粒。通过检测病毒RNA拷贝数、病毒蛋白的表达量等指标,验证拯救病毒的感染能力和抗病毒药物的抑制作用。结果 pBR322-EV-A71经体外转录所得RNA,在转染进入RD细胞后,观察到细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)并检测到病毒负链RNA,表明成功合成了EV-A71颗粒;拯救病毒颗粒在连续传代过程中,病毒增殖能力得以逐步提升,第4代病毒(R4 EV-A71)的感染能力强于第1、2、3代病毒(R1、R2、R3 EV-A71)(P<0.001),且已趋近于野毒株(wild-type EV-A71, wt EV-A71)水平(P>0.05);U0126和sorafenib两种ERK通路抑制剂可以有效抑制R4 EV-A71的增殖(P<0.001),且R4 EV-A71与wt EV-A71表现出同等程度的抑制作用。结论 pBR322-EV-A71可拯救出具有精确末端的EV-A71病毒颗粒,且其子代病毒可代替wt EV-A71进行病毒感染能力的评价和抗病毒药物的筛选。     

沙眼衣原体通过激活MAPK/ERK信号通路抑制宿主细胞凋亡

目的:研究沙眼衣原体抑制宿主细胞凋亡活性与MAPK/ERK信号通路的关系。方法:利用化学抑制剂U0126阻断MAPK/ERK信号通路,然后分别采用流式细胞术、Caspase-3活性检测试剂盒和Western Blot实验检测沙眼衣原体感染细胞在凋亡诱导剂Etoposide作用下细胞凋亡率和Caspase-3活性变化,以及PARP是否发生裂解。结果:当MAPK/ERK信号通路被阻断时,在Etoposide的作用下,沙眼衣原体感染细胞凋亡率明显上升,同时Caspase-3被活化和PARP发生裂解。结论:沙眼衣原体抑制宿主细胞凋亡活性与MAPK/ERK信号通路激活有关。     

κ-阿片受体激动对高糖诱导心肌肥大的影响

目的:研究κ-阿片受体(κ-OR)激动剂U50488H在高浓度葡萄糖(25.5mmol/L)诱导的心肌细胞肥大中的作用及可能的信号转导通路。方法:以原代培养的新生大鼠心肌细胞为模型,应用25.5mmol/L的高浓度葡萄糖诱导心肌肥大,用Lowry法检测心肌细胞蛋白含量;用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;用Western蛋白印迹法测定细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平。结果:25.5mmol/L的高浓度葡萄糖使心肌细胞蛋白含量和体积明显增加,1μmol/L的U50488H能抑制高糖诱导的心肌肥大,使ERK磷酸化水平降低,与10μmol/L的ERK抑制剂U0126对心肌肥大的抑制程度相近,统计结果没有显著性差异。结论:U50488H抑制高糖诱导的心肌肥大与ERK信号有关。     

肠道病毒A71型致人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B凋亡和S期阻滞的研究

肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)是手足口病的重要病原体,为研究EV-A71感染人扁桃体上皮细胞后对细胞凋亡和细胞周期的影响,确定ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)的作用,本文以人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B为细胞模型,CCK-8试剂盒检测EV-A71对UT-SCC-60B的抑制率、流式细胞仪检测EV-A71感染组和抑制剂处理组的凋亡和细胞周期、Caspase活力检测试剂盒测定Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。EV-A71以感染剂量和感染时间依赖方式抑制UT-SCC-60B增殖;EV-A71感染致UT-SCC-60B发生细胞凋亡,抑制ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt能够降低UT-SCC-60B细胞凋亡比例;EV-A71感染UT-SCC-60B后发生S期阻滞,抑制ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase阻止UT-SCC-60B发生S期阻滞;EV-A71感染UT-SCC-60B能够活化Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9且ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt调控Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。因此,EV-A71能够导致人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B发生凋亡和S期阻滞,并且ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase参与凋亡和S期阻滞的调控。     

Cyclosporin A通过MEK/ERK1/2信号通路调节滋养细胞titin表达

探讨MEK/ERK1/2信号通路在Cyclosporin A(CsA)诱导滋养细胞表达titin中的作用。应用RT-PCR、Western blot检测CsA诱导的滋养细胞titin的表达水平,Western blot检测CsA作用于滋养细胞后ERK1/2的活化程度,并观察MEK特异性抑制剂U0126对其mRNA转录的影响。发现CsA以时间和剂量依赖方式诱导titin表达,并刺激滋养细胞ERK1/2的活化,U0126以剂量依赖方式抑制CsA诱导的titin表达。结果表明CsA通过活化MEK/ERK1/2信号通路诱导滋养细胞titin 的表达,改变其生物学行为,从而有利于胚胎着床及早期发育。     

ERK1/2信号通路活化对Tamoxifen所致胶质瘤细胞凋亡的影响

为了探讨ERK1/2信号通路在他莫昔芬(tamoxifen, TAM)所致胶质瘤细胞凋亡中的作用,以C6和U87MG胶质瘤细胞为研究对象,经TAM处理后,采用MTT法检测细胞的存活率;倒置显微镜和DAPI染色观察细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡; Western-blot法检测细胞内ERK1/2磷酸化水平。最后应用ERK1/2抑制剂(PD98059)与TAM共同作用,观察其对胶质瘤细胞内ERK1/2磷酸化水平和细胞凋亡的影响。实验结果显示:TAM可呈浓度和时间依赖性地抑制胶质瘤细胞生长; TAM处理组的细胞凋亡明显增加且呈浓度依赖性;TAM能增加细胞内ERK1/2磷酸化水平;以PD98059阻断ERK1/2的激活,能增强TAM诱导细胞凋亡的作用。实验结果表明TAM能够抑制胶质瘤细胞生长和促进其细胞凋亡, ERK1/2信号通路的激活参与调控TAM所致胶质瘤细胞凋亡。     

Cyclosporin A通过MEK／ERK1／2信号通路调节滋养细胞titin表达

探讨MEK／ERK1／2信号通路在CyclosporinA(CsA)诱导滋养细胞表达titin中的作用。应用RT—PCR、Western blot检测CsA诱导的滋养细胞titin的表达水平,Western blot检测CsA作用于滋养细胞后ERK1／2的活化程度,并观察MEK特异性抑制剂U0126对其mRNA转录的影响。发现CsA以时间和剂量依赖方式诱导titin表达,并刺激滋养细胞ERK1／2的活化,U0126以剂量依赖方式抑制CsA诱导的titin表达。结果表明CsA通过活化MEK／ERK1／2信号通路诱导滋养细胞titin的表达,改变其生物学行为,从而有利于胚胎着床及早期发育。     

成纤维细胞生长因子21抑制脂肪细胞瘦素基因表达的分子机制

本研究旨在明确成纤维细胞生长因子21 (fibroblast growth factor 21, FGF21)调控脂肪细胞瘦素基因表达的分子机制。以3T3-F442A脂肪细胞为研究对象,用荧光定量RT-PCR检测瘦素mRNA表达,并用Western blot检测信号转导通路蛋白的磷酸化水平。结果显示,FGF21显著下调脂肪细胞瘦素mRNA表达水平,FGF21受体抑制剂BGJ-398完全阻断此作用。FGF21上调脂肪细胞ERK1/2和AMPK的磷酸化水平,ERK1/2抑制剂SCH772984和AMPK抑制剂Compound C分别可部分阻断FGF21抑制瘦素基因表达的作用,二者联合应用可完全阻断FGF21的抑制作用。PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂AZD5363对FGF21抑制瘦素基因表达的作用无明显影响。以上结果提示,FGF21可能通过FGF受体激活脂肪细胞ERK1/2和AMPK两条信号途径,抑制瘦素基因表达。     

GRP75经由Raf/Mek/Erk1/2信号转导通路抑制缺糖诱导的细胞凋亡

本文旨在探讨促存活信号通路Raf/Mek/Erk1/2是否参与了葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,GRP75)对缺糖诱导的细胞凋亡的抑制作用。GRP75过表达的PC12细胞给予Raf/Mek/Erk1/2通路抑制剂U0126预处理之后,无糖培养6、12和24h,同时以DMSO预处理的GRP75过表达PC12细胞组为对照。Western blot检测Erk1/2的磷酸化和表达水平,MTT实验检测细胞存活率,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核的形态学改变,流式细胞仪检测细胞亚二倍体峰,免疫荧光检测细胞色素c(cytochrome c,Cytc)向胞浆的弥散情况。结果显示:U0126在没有影响Erk1/2表达水平的前提下,阻断了GRP75对Erk1/2磷酸化水平的维持;U0126处理组的凋亡率明显高于对照组;U0126处理组Cytc从线粒体向胞浆释放的时间明显早于对照组,同时Cytc向胞浆的弥散程度大于对照组。以上结果提示,U0126通过抑制Erk1/2磷酸化,阻断了缺糖状态下GRP75对Cytc释放和细胞凋亡的抑制作用,这表明GRP75是通过Raf/Mek/Er...     

JNK、ERK信号通路在NaAsO2诱导骨髓间充质干细胞增殖中的作用

目的:研究c-ink氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)在亚砷酸钠(NaAsO2)诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)增殖中的作用.方法:体外培养骨髓间充质干细胞,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖,Western-blot检测磷酸化JNK、ERK表达水平.结果:低浓度1、2μ mol/L NaAsO2对BMSC有明显的促进增殖作用;高浓度16、32μ mol/LNaAsO2则对细胞生长产生抑制作用,具有一定剂量-效应关系;2、4、8μ mol/LNaAsO2处理BMSC 24h后,JNK磷酸化表达水平明显增加,ERK磷酸化表达水平明显降低;JNK抑制剂SP600125可明显降低高浓度16、32μmol/LNaAsO2的生长抑制作用;ERK抑制剂PD98059可抑制低浓度1、2μ mol/LNaAsO2对BMSC的促增殖作用.结论:低浓度NaAsO2激活ERK信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;高浓度NaAsO2激活JNK信号通路,提高细胞凋亡率,可被抑制剂SP600125阻断.NaAsO2致癌机制可能与JNK、ERK信号通路作用相关.     

急性白血病细胞中JAK/STAT5和PI3K/AKT信号通路对eIF4B的协同调控作用

人类急性白血病 (Acute leukemia,AL) 是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。在临床上,急性白血病由于发病急、病程短等原因使其非常难以治愈。已有研究表明,慢性白血病的发生与真核转译起始因子4B (Eukaryotic initiation factor 4B,eIF4B) 的活化密切相关,但是其在急性白血病发生中的作用尚不明确。为了探究eIF4B在急性白血病发生中的作用及其机理,利用PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂AKTi以及Pim抑制剂SMI-4A特异性地分别阻断JAK/STAT5/Pim和PI3K/AKT/mTOR信号通路,检测这两条信号通路下游共同靶标分子eIF4B的磷酸化水平。研究发现,阻断一条信号通路可明显降低eIF4B的磷酸化水平,而同时阻断两条信号通路能够更为显著地降低eIF4B活性并以一种协同作用的方式诱导细胞发生凋亡。进一步通过检测细胞凋亡和裸鼠致瘤实验,发现干扰eIF4B表达抑制了急性白血病细胞的存活及其在裸鼠体内的肿瘤形成。此外,敲低eIF4B可显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的蛋白表达水平。综上所述,在急性白血病细胞中eIF4B的活性受JAK/STAT5/Pim与PI3K/AKT/mTOR两条信号通路的共同调控,进而通过影响Bcl-2和Bcl-XL的表达发挥抗细胞凋亡作用,并促进急性白血病细胞介导的肿瘤生长。此研究有利于深入了解急性白血病的发生发展机制,为该病的靶向治疗提供理论指导。     

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测 p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量（TCID_５０）,以及观察感染细胞的细胞病变效应（CPE）等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与 ERK通路的关系. 结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.     

碳酸锂通过蛋白激酶C/丝裂原活化蛋白激酶信号调节海马神经元延迟整流钾通道

碳酸锂可以用于治疗创伤和神经退行性疾病导致的脑部损伤.研究表明其保护效应与蛋白激酶C(PKC)和胞外信号调节激酶(ERK)有关.研究表明PKC激动剂PDBu可以抑制延迟整流钾通道(IK)电流并使其激活电压曲线向超极化方向移动.碳酸锂(50 μmol/L)可以抑制PDBu的反应.进一步的研究表明,预先加入MEK/ERK抑制剂U0126(20 μmol/L),碳酸锂不能逆转PDBu对,IK的作用.因此,PKC和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK级联反应通路可能在钾离子通道的磷酸化调节中起作用.另外,AC-cAMP和GC-cGMP的交互作用也可能参与碳酸锂对PKC激活作用的调节,成为其神经保护作用的机制之一.     

Ⅰ型干扰素免疫应答作用机制研究进展

I型干扰素(IFN-Ⅰ)是机体固有免疫应答的一类重要的细胞因子,具有广谱的抗病毒及抗肿瘤等作用。近年来IFN-Ⅰ成为病毒学、疫苗学及肿瘤学等研究的热点,对干扰素诱导基因(ISGs)的功能研究进一步揭示了其抗病毒以及抗肿瘤的作用机制。麻疹病毒、流感病毒和肠道病毒71型等病毒均可通过与IFN-Ⅰ或其上、下游调节因子结合阻断IFN-Ⅰ信号通路,从而逃逸IFN-Ⅰ的抗病毒作用,这对病毒性疾病的防治是新的挑战。近期研究发现IFN-Ⅰ是疫苗诱导抗体产生的必要信号,同时参与调节T、B细胞的活化过程,在免疫应答过程中发挥关键作用。对IFN-Ⅰ免疫应答作用机制研究进行了综述。