细菌mtl—D基因的克隆及在转基因八里庄杨中的表达

运用ＰＣＲ方法克隆了大肠杆菌－１磷酸甘露醇脱氢酶（ｍｔｌ－Ｄ）基因,序列分析表明与已发表序列相比,除第４１６位密码子由ＡＡＡ代替ＣＡＴ、相应的氨基酸由Ｌｙｓ代替Ｈｉｓ外,其他部分均相同,该基因插入植物双元载体中,经土壤农杆菌介导导入地 杨,经卡那霉素筛选后再经盐胁迫筛选猁一批较高耐卤性的转化植株,在附加０．６％ＮａＣｌ的培养基中生长良好,而对照在附加０．４％,ＮａＣｌ的培养基中不能存活。对转化植株     

转抗盐基因八里庄杨组培苗快繁研究

以转1－磷酸甘露醇糖醇脱氢酶基因的八里庄杨为试材,筛选出了快繁的一系列培养基。分化培养基MS＋BA0.3mg.l^-1 IBA0.1mg.l^-1分化苗多,苗头密度高,叶色绿,并且可以节约对KT的使用。伸长培养基KT2.0mg.l^-1＋NAA0.1mg.l^-1使苗子伸长现象明显,苗子长势壮,叶子肥大。生根培养基以MS＋IBA0.2mg.l^-1为最佳,8天后开始生根,数量较多,生根后的试管苗生长粗壮,有利于移栽成活。以简化生根技术对杨树转化体进行生根试验,瓶外生根苗的移栽成活率明显比瓶内高,组培苗已成功移栽于大田中。     

甜菜碱醛脱氢酶基因在水稻中的表达及转基因植株的耐盐性研究

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是渗透调节剂甜菜碱生物合成中涉及的第2个酶,我们将含盐生植物山菠菜BADH基因的植物双元表达载体经基因枪法导入水稻,经盐胁迫筛选得到转化植株,经RAPD检测全部阳性,在随机选择的10株转化植株中全部测出BADH活性,而对照未见.Northern杂交表明,其中7株为阳性.在含0.5%氯化钠的盐池中大多数转基因植株生长基本正常,结实率约为10%,而对照受盐害现象显著,几乎全部枯萎.     

果聚糖蔗糖转移酶基因的克隆及耐盐转基因烟草的培育

用PCR方法克隆了枯草杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB),将其与克隆自酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羧肽酶A的液泡引导信号序列连接得到嵌合基因。测序验证后．插入含NPTⅡ基因的植物双元表达载体pBin438中,经农杆菌介导转化烟草。部分经卡那霉索筛选的抗性芽能在含1％NaCl的Ms培养基上正常生根,而未转化芽不能生根或根生长缓慢。转基因小苗移入盛蛭石的花盆并浇灌含1％NaCl的hoagland＇s营养液,17d后,其中一些转基因烟草植株生长良好,而未转化苗出现明显萎蔫。PR扩增及Nonhem分析证实SacB基因已导入转基因植株并得到转录。此结果表明SacB基因的植物基因工程可提高烟草植株的耐盐性。     

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在甜菜转基因植株中的表达

甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,BNYVV)是一种由甜菜多粘菌(Polymyxo be tae)传播的多分体植物病毒．基因组由4～5条单链正意RNA构成^[1]。60年代末,由Tamada首次报道^[2],这种病毒可对甜菜造成严重危害,侵染甜菜后产生丛根症状(Rhizomania),并导致甜菜产量和含糖 量的大幅度下降。除欧洲、北美及日本的严重发生以外,我国自70年代以来在东北、内蒙古及西北许多省区也有大量甜菜丛根病的发生报道^[3]。由于尚无有效药剂及措施用于甜菜丛根病或病毒传播介体的防治．在我国也无法采用大面积轮作作为防治手段,所以目前在世界各地及我国上述地区甜菜丛根病的发病面积逐年扩展,对甜菜生产和制糖业造成直接威胁。针对这一情况．本文报道了含有甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的甜菜植株的转化再生工作,以期在甜菜亲本育种中获得新的抗性材料．为抗病毒品种的培育打下基础。     

外源基因在转基因植物中的表达

外源基因在转基因植物中的表达王忠华夏英武舒庆尧（浙江农业大学核农所,杭州３１００２９）近十几年来,人们通过各种方法将外源基因导入植物体内产生许多转基因植物,包括水稻、小麦、棉花、烟草、大豆、番茄、马铃薯等重要粮食作物和经济作物。据不完全统计目前已获得...     

外源基因在转基因植物中的表达与稳定性

外源基因能否在转基因植物中稳定表达对转基因植物的应用前景有重要的影响。影响外源基因稳定表达的因素有多种,其中包括遗传和环境因素。在某些转基因植物中,外源基因表达是受发育调控,本文主要讨论了转基因沉默及发育时期和环境条件对源基因的表达及稳定性的影响,并进一步探讨了对策。     

胆碱脱氢酶基因的转化及转基因番茄耐盐性的鉴定

采用PCR方法从E.coliTG1菌株中扩增得到胆碱脱氢酶（choline     

胆碱脱氯酶基因的转化及转基因番茄耐盐性的鉴定

采用PCR方法从E.coli TG1菌株中扩增得到胆碱脱氢酶（choline dehydrogenase,CDH）基因（betA),其氨基酸编码序列与文献中的资料一致,且能在原核表达载体pBV221中正确表达,并表现出活性。构建该基因的植物表达框架pRbA,经农杆菌介导叶圆盘法转化番茄,对转基因番茄的PCR、Southern、RT－PCR分析证实betA已整合到番茄基因组中,转基因番茄的耐盐性高于对照番茄。     

作物抗旱节水相关基因的标记和克隆及转基因研究进展

介绍了国内外在小麦,大麦,水稻,玉米和大豆等重要农作物的抗旱节水相关基因性状的分子标记和基因克隆及转基因研究的最新进展。     

小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

Neurturin基因克隆及在大肠杆菌中表达

Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ（ Ｎ Ｔ Ｎ）是最近发现的一种与胶质细胞源性神经营养因子（ Ｇ Ｄ Ｎ Ｆ）相关的神经营养因子．利用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法以染色体 Ｄ Ｎ Ａ 为模板,扩增获得了编码人 Ｎ Ｔ Ｎ 成熟蛋白的基因,将其克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９ 质粒,进行序列分析,结果与文献报道一致．将基因重组于硫氧还蛋白融合表达载体ｐ Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ 系统,在宿主菌 Ｔｏｐ１０ 中获得了高效、稳定表达,表达的ｈ Ｎ Ｔ Ｎ 占菌体总蛋白 ２０％ 左右．这为进一步的基础研究与临床应用奠定了基础．     

人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。     

天花粉蛋白突变基因TCSA-S在大肠杆菌BL21中的表达

天花粉蛋白是具有N-糖苷酶活性的一种植物Ⅰ型核糖体失活蛋白,本研究用PCR方法获得了天花粉蛋白的突变基因TCSA-S,构建了表达载体pET-30a( )-TCSA-S,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在30℃条件下诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测,重组的突变体基因TCSA-S表达产物主要存在于包含体中。     

诺卡氏菌酰胺酶基因的分子克隆及在大肠杆菌中表达的初步研究

酰胺酶是一种重要的工业酶。利用生物信息学手段,在和已知酰胺酶基因序列分析比对的基础上,首次从Ncordiasp.YS-2002中成功地克隆得到酰胺酶基因ami,并对其基因序列及氨基酸序列的性质进行了分析。结果表明,所得酰胺酶基因ami片段大小共为1446bp,由启动子区、阅读框和回文结构终止区三部分构成。序列分析和进化树分析表明,Ncordiasp.YS-2002酰胺酶是一种比较特殊的酰胺酶,不含大多数酰胺酶共同具有的保守区序列。进一步将酰胺酶基因连接到pET-28a( )上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中筛选获得重组菌株PEAB。酶活测定结果表明重组菌具有酰胺酶酶活,但较低,其原因可能是因为大量表达的产物主要以包涵体的形式存在。     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。     

人白细胞介素22基因的分离及其在大肠杆菌中的克隆与表达

白细胞介素 2 2 (ＩＬ 2 2 )是 2 0 0 0年发现的一种新的人类细胞因子 ,它在多种组织中均有表达 ,包括胰腺、脑 ,肝、小肠、直肠和肾等 .在功能方面 ,ＩＬ 2 2上调肝细胞急性期产物 ,参与炎症反应[1～ 3] ;诱导胰腺相关蛋白ＰＡＰ1 Ｒｅｇ2和ＯＰＮ的高表达 ,表明ＩＬ 2 2参与胰腺免疫功能反应[4 ] ;它对ＣｏｎＡ刺激下Ｔｈ1细胞ＩＦＮ γ的产生没有明显的抑制作用 ,却大大抑制了Ｔｈ2细胞ＩＬ 4的分泌 ,这对于哮喘有潜在的治疗作用[1] .我们利用反转录ＰＣＲ获得了编码ｈＩＬ 2 2成熟蛋白的ｃＤＮＡ ,并构建了高表达载体ｐＢＶｈＩＬ 2 2 ,…     

人APRIL105-250基因的克隆与表达

目的 :克隆并表达人可溶性增殖诱导配体 (sAPRIL ,即人APRIL_105-250) ,为探索其在多种肿瘤细胞的增殖和存活以及促肿瘤形成中的作用奠定基础。方法 :从GENBANK中查找人APRIL蛋白 (编号:07588)序列 ,取其部分胞外 (APRIL_105-250)序列设计引物 ,用RT PCR从扁桃体总RNA中扩增出人APRIL_105-250基因 ,测序后将克隆载体经酶切并构建表达载体 ,在大肠杆菌中表达 ,并纯化蛋白。结果 :经克隆测序后进行同源比较 ,证实所克隆的基因即为人APRIL_105-250 基因。在大肠杆菌中表达量达 43.6% ,获得纯化蛋白。结论 :成功克隆与表达、纯化了人APRIL_105-250基因 ,为深入研究其功能奠定了基础 。     

载脂蛋白E3的克隆及原核表达

载脂蛋白Ｅ(ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ ,ａｐｏＥ)由 2 99个氨基酸组成 ,分子量 34ｋＤ ,是维持人体正常脂质代谢的必需蛋白质 .它是乳糜微粒 (ＣＭ )、极低密度脂蛋白 (ＶＬＤＬ)和高密度脂蛋白 (ＨＤＬ)的组分 ,是极低密度脂蛋白受体的重要配体 ,是脂质进入细胞不可缺少的中介 .ａｐｏＥ有 3种同分异构体 :ａｐｏＥ2、ａｐｏＥ3、ａｐｏＥ4 ,分别具有不同的生理作用 .ａｐｏＥ4与血浆高胆固醇、心血管疾病和老年痴呆等疾病关联[1～ 3 ] .ａｐｏＥ2与Ⅲ型高脂血症有关 ,并对老年痴呆有防治作用[4,5] .ａｐｏＥ3是大多数健康人所具有…