hpt与bar基因作为水稻转基因筛选标记的比较研究

标记基因的选择是影响植物遗传转化和转基因后代筛选成败的关键因素。hpt与bar作为两种常用的水稻转化筛选标记被广泛应用于水稻的转化。为比较两者在实际应用中的效果, 文章首先对比了在潮霉素和除草剂(Bialaphos)两种筛选剂下水稻遗传转化的情况。研究表明, hpt基因的转化筛选体系相对于bar基因在转化效率上提高近两倍, 转化周期提前至少10 d, 且插入基因拷贝数更低。随后, 文章分析了利用潮霉素浸种法在田间筛选转基因水稻的可行性, 研究显示当潮霉素浓度大于167 mg/L时, 可以对以水稻品种kitaake为亲本的转基因材料进行有效筛选, 达到常规除草剂的筛选效果。但与除草剂相比较, 潮霉素的田间筛选成本却处于劣势。文章研究和讨论了hpt和bar基因在遗传转化和后代田间筛选中的优缺点, 并提供了一种利用潮霉素浸种法筛选转基因后代阳性植株的手段, 为将来在水稻转基因研究工作中根据实际需求选择合适的遗传转化、筛选体系提供参考。     

中国遗传学会科普工作会议在京召开

培养温度是花药培养的一个十分重要的条 件。但是有关这方面研究的报道是不多的。特 别是早期的一些报道,不但内容比较简单,而且 试验的温度范围都在28℃ 以下^[7-9.14.16]近年 来甘肃农科院等一些单位开始试验用高温培 养,得到良好的效果^[4.5.10.15不过陈英等在水 稻上初步看到在高温培养下花粉愈伤组织的诱 导率虽然提高,但愈伤组织的分化能力有降低 的趋势,特别是当愈伤组织转分化培养基的时 间偏晚时更是如此^[5]。我们过去在小麦上也见 到过类似现象^[1]。因此近年来我们探索了在高 温下诱导的小麦花粉愈伤组织的分化能力的保 持间题。但在这一研究中又看到不同基因型对 培养温度有不同的反应,从而又就这种对培养 温度反应的基因型差异做了初步的遗传学分 析。本文先报道关于基因型差异方面的结果。 其他结果将另文报道。     

转基因水稻的研究和应用

植物基因工程的兴起,使特定的外源基因引入植物细胞成为可能。水稻转基因研究是国内外植物分子遗传学研究的热点之一。近十几年来,水稻转基因研究已取得显著进展。综述了水稻基因转化的方法、转基因技术在水稻上的应用及外源基因在转基因后代中的遗传表达的研究进展。     

转基因棉花外源基因的遗传

选用不同来源的转Bt基因抗虫棉中棉所30号和新棉33B、转tfdA基因抗除草剂棉花材料TFD,通过与不同主栽推广品种正反交,研究了外源Bt基因和tfdA基因在棉株体内的遗传和分离行为。结果表明,由于外源基因提供给转基因棉花的抗虫和抗除草剂性状均是由一对于基因控制的显性性状,且该性状不受细胞质效应的影响,符合孟德尔遗传规律。     

转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移

随着转基因技术的迅速发展, 越来越多的转基因作物被培育出来。转基因作物的外源转基因通过花粉传播向非转基因作物的漂移, 会影响非转基因作物品种的种子纯度, 从而可能导致一系列生物安全问题。为了研究转基因栽培水稻(Oryza sativa)中的外源转基因通过花粉介导向非转基因水稻品种逃逸的可能性及其频率, 我们选用3个含双价抗虫基因(Bt/CpTI)的转基因水稻品系及其相对应的非转基因水稻亲本品种(近等基因系)进行了转基因漂移的实验。为了获取在近距离状况下转基因水稻与非转基因水稻品种之间的转基因漂移频率, 采用了转基因与非转基因水稻品种间隔种植的栽培方式, 分别在福建省福州市和海南省三亚市的转基因环境安全实验地进行实验, 并利用潮霉素抗性筛选标记基因来鉴定转基因和非转基因稻的杂种。共检测了从非转基因水稻品种随机收获的70,056颗种子, 以此计算转基因漂移频率。结果表明, 在相邻种植的情况下, 由这3个转基因水稻向对应的非转基因水稻品种的转基因漂移的频率比较低(0.275–0.832％)。如此近距离条件下获得的低转基因漂移频率表明, 对于严格自花授粉的水稻而言, 通过一定的隔离措施, 能有效地降低由花粉介导的转基因漂移导致的非转基因种子混杂。     

两种筛选标记基因在水稻(Oryza sativa L.)遗传转化中的比较

筛选标记的有效选择(筛选周期及筛选效率)是影响作物基因转化成败的重要因素之一。该文在农杆菌介导水稻转化过程中,比较研究了两个标记基因(hpt和bar基因)对抗性愈伤组织产生时间及出愈率的影响。结果表明：以hpt为筛选标记,抗性愈伤组织出现周期短,出愈率高达20％左右;而bar基因作为筛选标记时,抗性愈伤组织块出现较慢,出愈率仅10％左右。因此,在水稻的农杆菌转化中,仅作为筛选标记,hpt基因的效果要明显优于bar基因。     

Bt/CpTI转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移

随着转基因技术的迅速发展,越来越多的转基因作物被培育出来。转基因作物的外源转基因通过花粉传播向非转基因作物的漂移,会影响非转基因作物品种的种子纯度,从而可能导致一系列生物安全问题。为了研究转基因栽培水稻(Oryzasativa)中的外源转基因通过花粉介导向非转基因水稻品种逃逸的可能性及其频率,我们选用3个含双价抗虫基因(Bt/CpTI)的转基因水稻品系及其相对应的非转基因水稻亲本品种(近等基因系)进行了转基因漂移的实验。为了获取在近距离状况下转基因水稻与非转基因水稻品种之间的转基因漂移频率,采用了转基因与非转基因水稻品种间隔种植的栽培方式,分别在福建省福州市和海南省三亚市的转基因环境安全实验地进行实验,并利用潮霉素抗性筛选标记基因来鉴定转基因和非转基因稻的杂种。共检测了从非转基因水稻品种随机收获的70,056颗种子,以此计算转基因漂移频率。结果表明,在相邻种植的情况下,由这3个转基因水稻向对应的非转基因水稻品种的转基因漂移的频率比较低(0.275–0.832%)。如此近距离条件下获得的低转基因漂移频率表明,对于严格自花授粉的水稻而言,通过一定的隔离措施,能有效地降低由花粉介导的转基因漂移导致的非转基因种子混杂。     

转基因水稻外源基因的漂移研究

转基因水稻基因漂移可能带来环境安全性问题。利用农杆菌介导,把hpt基因转化水稻品种,通过后代筛选,以稳定遗传的含单拷贝转化株系为转基因花粉供体材料,研究转基因水稻向非转基因水稻不育系和常规稻(花粉受体)的外源基因漂移频率。结果表明,相邻种植时转基因水稻向雄性不育系品种的漂移频率为31.74%。随距离的增加漂移频率明显下降,在26m处仍能够检测到含外源基因个体的存在,并且在距离4m处出现一个漂移频率的升高;转基因水稻向常规品种的漂移频率则明显低于不育系,一般在2.0%以下,随距离的增加也呈现下降的趋势,在18m处开始无法检测到含外源基因的个体。     

外源基因在转基因植物中的遗传特性

GeneticCharacterofForeignGenesinTransgenePlantsWangGuanlinFangHongJunNaJie(BiotechnologyInstituteofLiaoningNormalUniversity,Dalian116029)1外源基因在转化植株中的遗传传递规律关于外源基因在转化植株世代过程中的遗传传递规体已有较多的研究,一般从表型传达、标记基因的表达及分子杂交分析等方面进行研究,Braun等问‘早在1959年已证明,nopaline型Ti质粒农杆菌侵染植物细胞后产生的冠瘿瘤细胞中带有T－DNA,并保留一些形态发生潜力、但只能形成异常穿,亦称畸形痛。通过嫁接到正常烟草植株上可使这些异常穿开花结果…     

转Xa21基因水稻中T-DNA整合的遗传定位

利用转抗白叶枯病基因Xa21的水稻材料,通过TAIL－PCR方法扩增T－DNA整合的侧翼序列。从中筛选属于水稻基因组DNA的T－DNA整合的侧翼序列作为探针,将外源基因整合位点定位到窄叶青／京系17DH群体构建的水稻分子连锁图谱上。共获得属于水稻基因组DNA的T－DNA侧翼序列22个,其中的19个序列在定位群体的两个亲本之间显示RFLP多态性,分别定位在水稻基因组的第3,4,5,7,9,10,11和12染色体上。带有转基因Xa21的T－DNA整合的定位为研究外源基因在不同染色体位点的位置效应和稳定遗传打下基础。     

转基因玉米中目的基因的遗传表达及其抗病性研究

采用花粉介导方法将几丁质酶基因和潮霉素基因导入玉米(Zea maysL.)自交系海92-1中,以筛选抗玉米丝黑穗病的转基因品种.对转化植株及其后代植株的PCR、Southern blot检测表明,目的基因已导入转化植株并整合到其基因组中,且能够稳定遗传.ELISA分析证明转基因植株中目的基因可高效表达,表达产物量在9.8~16.3 ng?g-1鲜叶左右.统计分析显示,目的基因产物表达水平与转基因植株的抗病性呈极显著正相关(r=0.925,P<0.01).接种病毒鉴定结果揭示转基因株系的抗病性比对照提高3~4级.结合农艺性状筛选,选育到401、403这2个抗丝黑穗病且其它农艺性状优良的转基因纯合株系.     

玉米pepc基因在杂交转育的转基因水稻后代中的传递和表达特征

在合肥、海南两地以高光效转玉米pepc基因水稻为父本,与培矮64S、2302S、2304S、2306S、5129、02428、皖粳97和双九A等8个受体杂交,转育转pepc基因水稻新种质材料。至2002年已转育成一批转pepc基因水稻品系,对这些材料世代跟踪研究显示：(1)玉米pepc基因以一个显性基因稳定传递给后代,符合孟德尔分离规律,自交F2呈3：1分离,BC1为1：1分离;(2)玉米pepc基因在杂交转育的转基因水稻中高水平表达,与受体亲本相比,PEPC活性提高3.7～17．4倍,表达水平与受体亲本和转基因拷贝数有关,来源相同的世代间有相似的表达水平,但同一世代不同个体间表达水平有差异,这可能与其位置效应、拷贝数和环境条件有关;(3)杂交后代结实率不高,容易产生异交结实导致转基因材料混杂分离。采取抗生素催芽初筛、PCR分析抽检、PEPC活性测定和田间表型观测的转玉米pepc基因水稻选育筛选体系,辅之以受体为轮回亲本适当回交可有效地控制。利用该途径已育成3个稳定的高表达的转玉米pepc基因水稻品系H1596、H1597和Y1470,说明通过常规杂交转育的方法,可以培育实用的稳定高表达的转玉米pepc基因水稻品种。     

基因枪转化的bar基因表达盒在水稻中遗传行为复杂

基因枪介导基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)转化是基因枪转化植物的新趋势,它能消除质粒载体主干序列对转基因植物的不利影响。本文研究了基因枪转化的bar基因表达盒在转基因水稻T1～T3世代中的遗传行为。结果发现:作为筛选标记的bar基因表达盒在水稻基因组中多拷贝整合,遗传分离行为复杂,还出现了Basta抗感分离比在35:1～144:1之间的"假纯合体",但50%转基因株系中(5/10)bar基因可作为一个显性基因按孟德尔方式稳定遗传至自交T2代。虽然bar基因为多拷贝整合,30%的转基因株系(3/10)在自交低世代(T1)能获得纯合体。Southern杂交分析发现,多拷贝的bar基因表达盒倾向于连接成转基因串联子整合在水稻基因组内。我们发现在Basta抗性正常分离的株系后代中bar基因表达盒Southern杂交模式能稳定遗传,但异常分离的株系后代中bar基因表达盒的一些拷贝发生了丢失。我们推测,bar基因表达盒在水稻中遗传分离行为的复杂原因可能是bar基因表达盒多拷贝整合、基因丢失和基因表达互作。     

基因枪转化获得的转基因水稻中外源基因整合与表达规律研究

通过基因枪法将cecropin B和bar基因共转化水稻,获得多个水稻优良品系的转化材料,对转基因的结构和表达的系统分析,发现外源基因的整合模式多种多样,有简单也有复杂,其中插入位点数的变化范围为1－7个,拷贝数的变化范围为1－10个,转基因拷贝数的多少与其表达和沉默不存在必然的联系,相同整合模式的转基因事件中基因的表达存在较大的差异,选择标记基因bar比非选择标记基因cecropin B的表达框的完整性和转录概率要高,但是发现大部分表达框完整的bar基因发生基因沉默,而在终止子发生序列丢失的cecropin B基因的表达则明显提高。     

转基因小鼠中外源基因遗传及表达稳定性的研究

挑选两个乳汁中人凝血因子IX（hFIX）表达量相差较大的转基因小鼠家系,分别用PCR、Southern blot、FISH和ELISA对两个家系中的小鼠进行检测。结果显示后代小鼠的转基因阳性率为50%左右;外源基因的整合是完整的,没有发现可见的丢失现象;家系中的各个小鼠表达量有差异,FIX-33家系中hFIX在乳汁中的表达量为（43.32±5.41）?g/mL;FIX-124家系中hFIX在乳汁中的表达量是（1.16±0.45）?g/mL。而两个家系之间的表达量则差异极为显著(P<0.01)。这表明原代转基因小鼠的遗传及表达特性可以得到稳定的传递。     

脆茎基因在水稻亚种间杂种后代中的遗传

脆茎基因在水稻粳型品种间杂种后代中按孟德尔遗传比例传递,而在亚种间杂种后代中呈脆茎(bcl bcl)频率显著增加和显著降低两种偏离孟德尔比例的异常分离型。Kamairazu／／Ketan Nangka／Kamairazu F1呈脆茎频率增加型,F2群体则呈正常分离,但F3和F4仍出现少数增加型和降低型的株系。IR36／Kamairazu的F2呈降低型分离,F3和F4株系中有正常型和降低型两种,F4还出现个别增加型株系。Ketan Nangka／IR36／／Kamairazu的F2中除了有增加型和降低型外,出现部分正常型。水稻bcl基因的异常分离与花粉育性无关,而是由雄配子选择性授精引起,与位于第3染色体的配子体基因ga2、ga3和ga14有关。     

苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生

通过农杆菌介导法将高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿,成功地诱导转基因植株再生,转化植株生长和发育良好,苜蓿子叶外植体是较理想的转化受体。冷凉湿润的环境条件是苜蓿移栽成活率高所必需的。     

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac／Ds转座子系统在水稻(Oryza sativa,L．)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA分别转入到不同的水稻植株,再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1植株,Fl自交产生F2后代,F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离,在总共100株F2水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明,利用Ac／Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。