粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

根据GenBank中公布的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)N-糖酰胺酶(Png1p)cDNA序列, 设计并合成一对特异性引物, 利用RT-PCR技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cDNA。将得到的基因克隆到表达载体pET-15b中。重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中, 经诱导表达和纯化提取后, 进行酶活测定。实验结果表明, 该酶的分子量约为39 kD, 纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除, 且这种作用需要还原剂DTT的辅助作用; N-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用, 对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母Png1p在不同温度、pH、DTT浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B(RNase B)的脱糖基化检测发现, 重组酶的最适反应温度30°C, 最适反应pH为7.0, 需要的最适DTT浓度为10 mmol/L, 底物在100°C处理10 min时酶的脱糖基化率最高。     

N-糖酰胺酶F在大肠杆菌中的高效表达及其脱糖基化作用研究

从脑膜炎脓杆菌（Flavobacterium meningosepticum）基因组中通过PCR扩增了N-糖酰胺酶F（PNGase F）基因,经酶切后与表达载体pET28a连接,获得的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。重组大肠杆菌经诱导表达和纯化提取后,获取大量高纯度N-糖酰胺酶F,其纯度达90%以上。试验证明,经纯化的重组N-糖酰胺酶F可以切除核糖核酸酶B、转铁蛋白和人IgG等糖蛋白上的N-糖链,具有脱糖基化作用。     

粟酒裂殖酵母钙调素基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的分离纯化

用带有粟桌酒裂殖酵母钙调索基因的质粒PEC/PCA和质粒PSB6来转化大肠杆菌SB1,扩增培养后破碎离心,上清液经Phenyl-SepharoseCL－4B柱、DEAEcellulose-52柱、SephedesG－75柱分离,得到纯化的表达产物,此产物经SDS—PAGE电泳鉴定和对环核苷酸：酷酶（cyclicnucleotidephosphodiesterase,PDE）活性的激活鉴定,确定为酵母钙调素,且其分产量小于猪脑钙调素。     

布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及活性测定

苯丙氨酰-tRNA合成酶是布氏锥虫蛋白合成过程中的一类重要酶,以其为靶点的抑制剂可能发展成为新一代的抗锥虫药物,但此前并没有分离锥虫苯丙氨酸-tRNA合成酶的报道。本研究用大肠杆菌成功克隆表达并纯化了布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶并进行了活性测定。首先通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中分别扩增出苯丙氨酰-tRNA合成酶的α亚基、β亚基的基因,依次克隆入pCOLADuet共表达载体,然后在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中进行了成功表达,并采用Ni-Bind亲和层析对其进行了纯化,最后用免疫印迹进行了鉴定。此外还采用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫苯丙氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。     

水稻几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

将克隆并确定序列的水稻(Oryza sativa L．Cpslo17)几丁质酶基因Oschi的cDNA序列(此序列已在GenBank中注册, 登录号为EU045451)插入原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切、序列鉴定分析后, 用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3); 经IPTG诱导获得表达, 并对Oschi蛋白表达条件进行了优化; 在大肠杆菌中表达的几丁质酶经纯化后在一定的浓度、一定的反应时间内能高效地分解几丁质。     

鸡氨肽酶H在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物组织内一种常见的氨基内肽酶, 但因为天然材料中含量很低, 基本无法深入研究其催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。从鸡肝组织克隆了APH的全基因序列, 并把该序列亚克隆到载体pET22b(+)上, 然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 构建了APH的表达菌株。该菌株经IPTG诱导, 在SDS-PAGE上明显出现一条与天然APH理论分子量一致的新增蛋白带, 该条带的浓度随着表达时间的延长逐渐加深; 6 h基本达到平衡, 此时重组蛋白占总蛋白的16.7%, 表达水平高达94.7 mg/L。对表达产物进行了活性检测、纯化和酶学性质分析, 发现重组蛋白在亚基构成, 热稳定性, 最适pH等方面与天然APH基本相同, 据此可以确认表达产物确实是APH, 发酵液总活力达到1636 u/L。这些结果为APH的催化机理及其在生物体内的功能的阐明奠定了重要的物质基础。     

水稻几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

将克隆并确定序列的水稻(Oryza sativa L．Cpslo17)几丁质酶基因Oschi的cDNA序列(此序列已在GenBank中注册, 登录号为EU045451)插入原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切、序列鉴定分析后, 用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3); 经IPTG诱导获得表达, 并对Oschi蛋白表达条件进行了优化; 在大肠杆菌中表达的几丁质酶经纯化后在一定的浓度、一定的反应时间内能高效地分解几丁质。     

鸡氨肽酶H在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物组织内一种常见的氨基内肽酶, 但因为天然材料中含量很低, 基本无法深入研究其催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。从鸡肝组织克隆了APH的全基因序列, 并把该序列亚克隆到载体pET22b(+)上, 然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 构建了APH的表达菌株。该菌株经IPTG诱导, 在SDS-PAGE上明显出现一条与天然APH理论分子量一致的新增蛋白带, 该条带的浓度随着表达时间的延长逐渐加深; 6 h基本达到平衡, 此时重组蛋白占总蛋白的16.7%, 表达水平高达94.7 mg/L。对表达产物进行了活性检测、纯化和酶学性质分析, 发现重组蛋白在亚基构成, 热稳定性, 最适pH等方面与天然APH基本相同, 据此可以确认表达产物确实是APH, 发酵液总活力达到1636 u/L。这些结果为APH的催化机理及其在生物体内的功能的阐明奠定了重要的物质基础。     

链球菌噬菌体裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

噬菌体裂解酶是噬菌体产生的细胞壁水解酶,通过水解宿主菌细胞壁使子代噬菌体释放,在体外能高效且特异性地杀死细菌。本研究旨在克隆和表达链球菌噬菌体裂解酶PlyC,并测定其生物学活性。利用PCR方法扩增PlyC的2条肽链PlyCA和PlyCB,构建表达载体pET-32a(+)-PlyCA和pET-32a(+)-PlyCB,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,以0.7 mmol/L IPTG在30 oC诱导7 h实现了高效表达,SDS-PAGE分析表明PlyCA和PlyCB表达量均可达菌体总蛋白的30%以上。采用Ni2+-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,其纯度大于95%。用透析复性方法得到目的产物重组链球菌噬菌体裂解酶PlyC,以浊度法和平板计数法检测其体外抗菌效果,扫描电子显微镜观察裂解酶作用前后细菌细胞形态变化。结果表明重组PlyC能特异性裂解化脓性链球菌(A组β-溶血性链球菌),以4μg/mL浓度作用于OD600为0.56的菌液60 min后杀菌率达99.6%,扫描电镜观察结果显示该酶作用于菌体后,链球菌细胞裂解,呈碎片状态。本研究为开发一种新型、高效的链球菌感染疾病治疗药物打下了基础。     

詹氏甲烷球菌DNA连接酶在大肠杆菌中的表达纯化及连接活性鉴定

对一种耐热性古茵--詹氏甲烷球茵(Methanocaldococcus jannaschii)的DNA连接酶进行了克隆、表达、纯化,并对其生物化学特性和酶学活性进行了初步研究.詹氏甲烷球菌DNA连接酶重组蛋白在ATP及Mg<'2+>二价阳离子存在的条件下具有连接酶活性,能够封闭DNA链上的切割.通过不同温度下的测试,50～80℃为较适合连接温度,其耐热性强,甚至在90℃下加热5 min后仍有连接酶活性;其发挥活性的pH值范围比较宽泛.最适pH值为6.0～9.0.这是国际上对詹氏甲烷球菌DNA连接酶的首次报导.     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

Molecular identification and characterization of peptide: N-glycanase from Schizosaccharomyces pombe

Peptide:N-glycanase (PNGase) is an enzyme responsible for deglycosylation of misfolded glycoproteins in so-called endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) system. In this study, we reported the molecular identification and characterization of SpPNGase (Schizosaccharomyces pombe PNGase). Enzymatic analysis revealed that SpPNGase deglycosylated the misfolded glycoproteins and distinguished native and denatured high-mannose glycoproteins in vitro. The deglycosylation activity was lost with the addition of chelating agent EDTA and was not restored by re-addition of metal ions. By construction of deletion mutant, we confirmed that N-terminal α-helix of SpPNGase was responsible for the protein-protein interaction. Combining the results from ternary structure prediction and dendrogram analysis, we suggested that the N-terminal α-helices of PNGase are derived from evolutionary motif/peptide fusion.     

Coflocculation of Escherichia coli and Schizosaccharomyces pombe

Several yeasts, such as Candida utilis, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora guilliermondii, Kloeckera apiculata, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, were found to coaggregate with Escherichia coli, but S. pombe showed much less coflocculation than the other yeasts (Peng et al. 2001)). S. pombe is known to have galactose-rich cell walls and we investigated whether this might be responsible for its different behavior by studying the wild-type TP4-1D, with a mannose to galactose ratio of 1 to 1.2, and the glycosylation mutant gms1delta (Man:Gal=1:0). The wild-type induced very low levels of coflocculation (3%) while gms1delta induced a remarkable amount of coflocculation (48%). Coflocculation of the mutant was inhibited by mannose but not affected by galactose or glucose. The S. cerevisiae mnn2 mutant, with a mannan structure similar to gms1delta, also showed a high degree of coflocculation (40%). However, S. cerevisiae mutant mnn9, with a mature core similar to S. pombe, showed decreased coflocculation (21.3%). Both these S. cerevisae mutants were sensitive to mannose inhibition. Coflocculation of E. coli and gms1delta also could be inhibited by gms1delta mannan and plant lectins, such as HHA, GNA and NPA, specific to either alpha-1-3- or alpha-1-6-linked mannosyl units. From these results we conclude that the E. coli lectins may have specificity for alpha-1-6- and alpha-1-3-linked mannose residues either in the outer chain or in the core of S. pombe, but in wild-type strains these mannose residues are shielded by galactose residues.     

重组牛肠激酶轻链基因在大肠杆菌中的表达与纯化

肠激酶（Enteroloinase,EK,EC3.4.21.9）是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,通过在位点（Asp）4-Lys的羧基端进行高效特异酶切,将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶。以GenBank公共数据库中牛肠激酶轻链基因序列（Accession No.NM174439）设计引物,利用RT-PCR方法合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆进pET39b载体中DsbA片段的C’端,转化大肠杆菌BL21（DE3）,获得DsbA/牛肠激酶轻链融合蛋白,经镍离子螯合层析纯化,每升培养液中可得到2.7-3.0mg重组牛肠激酶,对含有肠激酶酶切位点的IL-11/MBP融合蛋白进行酶切,结果表明,酶解率可达到95%以上,为重组牛肠激酶的大规模生产打下了基础。     

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白, 电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示, 表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白, 分子量为27 kD, 100 mL表达菌液可获得13.1 mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠, 复性率为18%, 在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定, 结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。     

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白, 电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示, 表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白, 分子量为27 kD, 100 mL表达菌液可获得13.1 mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠, 复性率为18%, 在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定, 结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。     

白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中表达纯化及性质研究

CRM197是一种白喉毒素突变体,作为载体蛋白广泛用于疫苗开发。将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pET25b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,CRM197获得高效表达,达到菌体总蛋白的20%。目的蛋白主要以包涵体形式存在,变性、复性后经DEAE阴离子交换、S-100分子筛纯化获得纯度高于95%的CRM197样品,用该蛋白样品免疫新西兰大白兔,免疫兔血清中检测到特异性抗体应答。急性毒性试验中,每只豚鼠皮下注射200μgCRM197纯化样品,未出现明显毒性反应症状,与之相比较,注射后48h内,20ng白喉毒素阳性对照组动物全部死亡。结果表明,利用本试验的表达策略,CRM197得到高效表达,并且具有良好的免疫原性和安全性,为其进一步生产及应用奠定基础。     

Purification and Characterization of Two Dihydroxyacetone Kinases from Schizosaccharomyces pombe IFO 0354

Two dihydroxyacetone kinases (DHAKs), DHAK I and DHAK II, were purified to homogeneity from Schizosaccharomyces pombe IFO 0354. They were immunologically different from each other. Although both of the enzymes had some affinity for glycerol and dl-glyceraldehyde in addition to dihydroxyacetone and glyceraldehyde, V(infmax) values for dihydroxyacetone were much higher than those for glycerol and dl-glyceraldehyde. On the basis of the K(infm) values of both enzymes for dihydroxyacetone, DHAK II plays a more important role than DHAK I in dissimilation of glycerol via dihydroxyacetone.     

Expression and purification of the carboxyl terminus domain of Schizosaccharomyces pombe dicer in Escherichia coli

The carboxyl terminus domain of Schizosaccharomyces pombe dicer (yDicerC) was expressed in Escherichia coli as an MBP-fusion protein (MBP-yDicerC). When the E. coli strain was cultured and induced at 25 degrees C, the MBP-yDicerC was partly expressed in the soluble fraction. It was then purified by two step affinity chromatography with amylose resin and Ni-NTA His Bind(R) resin. The purified MBP-yDicerC showed double-strand RNA digestion activity. siRNA-like products about 22-nt in length were generated.