大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

变铅青链霉菌启动子的克隆和表达

利用启动子探测质粒pIJ486(Tsr~(?) Neo~(?))将变铅青链霉菌(streptomyces lividans)TK24染色体DNA的BamHI酶切片段插入pIJ486的BamHI位点。获得4个硫链丝菌肽抗性、新霉素抗性的重组质粒。它们分别命名为pMGI(10.6kb)、pMG40(7.6kb)、pMG50(10.8kb)和pMG88(7.92kb)。BamHI酶切分析及再转化试验表明,新霉素抗性的恢复确实来自载体的外源插入序列。用BgⅢ酶切已将pMG40的插入序列缩小到0.78kb的pMG40-2,pMG50的插入序列缩小到2.2kb的pMG50-25,仍保留启动子活性。重组质粒pMG50-25的新霉素抗性水平高达90μg/ml(卡那霉素抗性水平为500μg/ml),表明这是一个活性很强的启动子。     

大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的构建及应用

pIJ6021和pIJ4123是链霉菌的高拷贝表达载体,它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子P_tipA。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因(bla),得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复制、并保持结构稳定的链霉菌表达载体：pHZ1271和pHZ1272。将透明颤菌(Vitreoscillia sp.)血红蛋白基因(vhb)克隆到pHZ1272中,用它转化变铅青链霉菌(Streptomyces lividans),经Western blotting分析和CO结合实验表明,在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白,从而证明所构建的pHZ1272载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌lat基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRI-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌lat基因的序列及质粒pIJ77(3 pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒)中阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的lat基因两端的互补序列,以质粒pIJ773为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有lat基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的lat基因同源序列与pGH112-lat中的野生型lat基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入lat基因中,得到lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌lat基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。     

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌励基因插入突变的重组质粒pELA

本实验将PCR所得的1．8kb的地基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat．经EcoRI—HindⅢ双酶切后得到妇基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E．coli BW25113／pIJ790中得到E．coli BW25113／pIJ790／pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌纽基因的序列及质粒pIJ773（pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒）中阿泊拉抗性基因（aac（3）iv）的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的纽基因两端的互补序列,以质粒pip73为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有纽基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E-coli BW25113／pIJ790／pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的纽基因同源序列与pGH112-lat中的野生型勉基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入地基因中,得到纽基因中插入阿泊拉抗性基因（lat：：apr）的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌地基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。     

麦迪霉素产生菌具有启动功能的DNA片段的克隆和分析

利用启动子探针质粒载体pIJ486从麦迪霉素产生菌总DNA中克隆得到了一段具有启动功能的DNA片段.通过限制性酶酶切分析,测定插入DNA片段大小为2.3kb.又利用载体pIJ486和pIJ487的新霉素抗性结构基因上游有多酶切点方向相反的性质,分析了插入片段在两个不同方向上的启动能力.结果表明,在两个方向上均有启动功能,但强弱相差六倍.其中在XbaI-HindIII方向上具有较强的启动能力,在变铅青链霉菌中新霉素抗性水平可达20mg/ml以上.进一步对插入片段的三个BamHI小片段进行分析的结果表明,较强启动子区域集中在BamHI-BamHI 0.79kb DNA片段上.     

糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM的构建

对糖多孢红霉菌染色体上红霉素生物合成基因进行改造 ,已经合成了多种红霉素类似物。在糖多孢红霉菌中对红霉素类似物进行结构修饰 ,以pWOR1 0 9质粒为基础构建糖多孢红霉菌多拷贝表达载体pZM。pZM载体带有PermE启动子、fd终止子、多克隆位点、硫链丝菌肽和氨苄青霉素抗性基因、以及在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中复制的ColE1ori和pJV1ori复制子 ,系可在大肠杆菌和糖多孢红霉菌中扩增的穿梭质粒。在糖多孢红霉菌中 ,pZM可以表达氨普霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因 ,从糖多孢红霉菌中提取的表达质粒酶切图谱与转化前一致 ,表明pZM是糖多孢红霉菌中多拷贝、稳定的表达载体。     

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ,用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达,但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导,则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失,但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子,且可在阿维链霉菌中稳定遗传,却不能再转化大肠杆菌。     

透明颤菌血红蛋白基因在金色链霉菌中的克隆与表达

分别用质粒pJJ699与pUC19(vhb),pIJ702与pBR322(vhb),构建大肠杆菌链霉菌穿梭质粒,将透明颤菌血红蛋白基因转入金色链霉菌。在低溶解氧浓度下,透明颤菌血红蛋白的表达,可提高金色链霉菌氧的利用效率,产物合成比原始菌株提高40%～60%。在局部低氧的环境中,采用四环素抗性基因启动子带动血红蛋白基因表达,可有效发挥透明颤菌血红蛋白的氧传递效率,优于透明颤菌血红蛋白基因受溶解氧调控的天然启动子。     

一个枯草杆菌启动子(P_(28-1))对链霉菌分化的影响

亚克隆1.1kb的枯草杆菌启动子P_(28-1)到pUC19上,再亚克隆到以儿茶酚加氧酶为报告基因的链霉菌启动子探测质粒pIJ4083上,构建的重组质粒命名为pIJ4498.用pIJ4498转化天蓝色链霉菌J1501的原生质体,得到了相对于灰色野生型的白色转化子,而用载体pIJ4083转化J1501后得到的转化子是正常的深灰色菌落.经限制性内切酶验证了重组质粒的结构,测定了质粒的稳定性.当pIJ4498转化天蓝色链霉菌的WhiG突变株(C71)后,未观察到任何表型的变化.通过超声波破碎细胞得到的J1501/pIJ4498菌体的蛋白提取液,可使无色的儿茶酚氧化成黄色的2-羟粘糠酸半醛(HMS).而对照株J1501/pIJ4083及C71/pIJ4498菌株的蛋白提取液不能使儿茶酚氧化成黄色的HMS产物.结果表明枯草杆菌的启动子P_(28-1)被天蓝色链霉菌J1501的σ^(whiG) RNA聚合酶所识别,在启动儿茶酚加氧酶报告基因表达的同时,影响了天蓝色链霉菌J1501分化中的孢子形成.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。