磷酸酶的三种铈法光镜定位比较

我们用Ce-DAB法、Ce-Pb法和Ce-Pb- AgS法对兔肾和肝脏的四种磷酸酶进行了光镜定位,并对这三种铈法进行了比较。Ce-DAB法反应较强,Ce-Pb-AgS法次之,Ce-Pb法反应较弱。但用这3种方法在光镜下均可清晰地显示这4种磷酸酶的活性,从而使铈法可同时应用于电镜和光镜下的磷酸酶的活性定位。     

酚氧化酶及其酶原的研究进展(Ⅱ)——免疫学特性、细胞定位及其功能

酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）又称为酪氨酸酶（tyrosinase,EC1．14．18．1）,是一种含铜的酶,能够催化单酚羟化成二酚（如多巴）,并把二酚氧化成醌;醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素。PO在脊椎动物和无脊椎动物中都广泛存在,而且被认为是一种参与免疫的重要因子。本文就酚氧化酶及其酶原的免疫学特性、细胞定位及其功能研究进展进行综述。     

透明颤菌血红蛋白对两种D-氨基酸氧化酶的不同影响及机理研究

D-氨基酸氧化酶是两步酶法制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)这一半合成头孢类抗生素的主要前体的关键酶.它催化的反应是需氧反应,反应体系的溶氧水平是酶活的限制因素之一.我们发现将纯化的透明颤菌血红蛋白(VHb)分别添加到三角酵母来源(TvDAO)和红酵母来源(RgDAO)的D-氨基酸氧化酶的纯酶中,可提高这两种氧化酶的活力35%和48%.细菌双杂交实验证明,透明颤菌血红蛋白与RgDAO有相互作用,而与TvDAO没有关联.这说明透明颤菌血红蛋白对氧化酶活力的促进是由于自身向氧化酶提供游离氧,而且它与氧化酶之间的相互作用可以增强这种效果.我们可以利用透明颤菌血红蛋白的这种性质把它作为氧化酶酶促反应的添加剂,提高酶促反应的效率,如果该氧化酶与之有相互作用,效果会更加显著.     

铈代替铅电镜酶组织化学显示培养脊神经节神经元TMP活性

目的探讨铈法显示脊神经节神经元初代培养细胞的TMP(三偏磷酸酶)活性。方法应用电镜酶组化技术,以铈作为捕捉剂代替常规以铅作为捕捉剂来检测观察脊神经节初代培养的神经元内溶酶体的TMP活性。结果脊神经节神经元初代培养细胞内存在TMP阳性的溶酶体,其TMP阳性反应颗粒较常规以铅作为捕捉剂来显示溶酶体不仅孵育液充分溶解呈清亮透明,电镜下反应产物颗粒也微细均匀,而且避免了反应产物的扩散及非特异性沉淀。结论以铈作为捕捉剂来检测溶酶体的TMP活性用于电镜下观察,其方法稳定、易行,是一种能很好显示溶酶体标记酶的电镜酶组化技术方法。     

昆虫酚氧化酶原激活酶研究

昆虫酚氧化酶原激活酶(Prophenoloxidase activating proteinase,PAP)是酚氧化酶原激活过程中的一个关键酶,是昆虫先天性体液免疫体系的重要组成部分。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对酚氧化酶原激活酶的前体进行剪切激活,而激活后的酚氧化酶原激活酶能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来消灭外源物。本文综述了昆虫酚氧化酶原激活酶的结构与特性及其在酚氧化酶原级联激活系统中的作用机制,并探讨了寄生蜂对寄主昆虫酚氧化酶原激活酶的调控。     

乙醇酸氧化酶基因在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

将菠菜乙醇酸氧化酶基因片段克隆至表达载体pPIC3．5k。提取重组质粒,进行限制性酶切鉴定。重组质粒用Sal I酶切线性化,电导入法转化毕赤酵母(Pichia pastoris),在缺乏组氨酸的RDB平板筛选重组子,提取酵母的染色体基因组进行PCR扩增鉴定整合情况,用甲醇诱导表达。结果表明,SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的分子量约为39．8kD,与文献报道的乙醇酸氧化酶分子量接近。酶的活力达到了40．8IU／g湿菌体,比不含有目的片断的对照菌酶活提高了17倍,确认了导入的乙醇酸氧化酶基因片段在酵母中高效表达。     

单胺氧化酶

单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）是生物体内一种十分重要的酶,它在大脑和周围神经组织中催化一些生物体产生的胺,氧化脱氨产生过氧化氢（H₂O₂）.单胺氧化酶A和B基因的克隆清楚地证明了这些酶是由不同的多肽组成的.单胺氧化酶A和B的基因定位于X染色体（Xp11.23）,都由15个外显子组成,而且它们的内含子-外显子组织是完全一致的.这些事实表明单胺氧化酶A和B的基因很可能从同一个祖先进化而来.单胺氧化酶A和B具有不同的底物和抑制剂专一性,在生物神经递质代谢和行为方面具有不同的作用.     

植物乳杆菌源胺氧化酶的异源表达及功能结构分析

【目的】生物胺是一类广泛存在发酵食品中潜在有害物质,可被胺氧化酶分解。本研究对来源于乳酸菌的胺氧化酶的酶学性质及其降生物胺能力进行了探究。【方法】本研究在大肠杆菌中异源表达了植物乳杆菌中多铜氧化酶基因SufI,经过优化表达条件与纯化重组酶后,分析了该酶的最适反应条件、酶稳定性、降生物胺能力、光谱与结构特性。【结果】重组酶的最适pH值为3.5,最适温度为20℃,在pH 4.0–10.0或15–65℃的条件下,相对酶活力保持在70%以上。重组酶具有较好的稳定性,酶活不受乙醇等抑制剂的影响。在8种生物胺的混合体系内,重组酶对生物胺总量的降解量可达403.23μg/mL,其中对酪胺的降解量最多,超过70μg/mL (34.99%)。在单一生物胺体系内,重组酶对酪的底物亲和性较高,酶活可达18.33U/mL。紫外-可见扫描光谱显示酶蛋白在600 nm处有多铜氧化酶家族特征吸收峰,傅里叶红外光谱解析酰胺Ⅰ带中α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲的相对含量分别为21.52%、20.72%、33.80%和23.97%。同源建模预测该酶具有3个铜结合域,且含有组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸等铜配体结合...     

硫化氢与NADPH氧化酶

硫化氢(H2S)被认为是继NO和CO之后的第三种气体信号分子,是一种新的内皮细胞源性血管舒张因子,在平滑肌松弛、海马长时程增强、脑发育和炎症等方面发挥着重要的生理病理作用。H2S具有很强的抗氧化作用,被认为是其发挥生理病理作用的重要机制之一。NADPH氧化酶是生物体内产生活性氧类(reactive oxygen species,ROS)的主要酶,在动脉粥样硬化、肾间质纤维化等的发生和发展起着关键作用。本文重点综述生理浓度下H2S对NADPH氧化酶的抑制作用及其机制,并简述其重要的生理病理意义。     

环氧化酶—2及其研究进展

环氧化酶有两种同工酶，环氧化酶－２（ＣＯＸ－２）是受细胞内外相应刺激如细胞脂多糖、细胞因子作用合成的诱导型酶。ＣＯＸ－２在基因结构、表达调控、编码蛋白、定位分布上均与ＣＯＸ－１不完全相同。ＣＯＸ－２是炎症过程中一个重要的诱导酶，在肿瘤的形成与发展过程中也有一定作用。     

槐尺蠖多酚氧化酶的纯化及酶学特征

经40%饱和度硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-100凝胶过滤等步骤,将槐尺蠖Semiothisa cinerearia Bremer et Grey 多酚氧化酶纯化,纯化倍数为6.96倍。该酶对焦性没食子酸,邻苯二酚和L多巴的Km值分别为0.23 mmol/L, 0.48 mmol/L和0.49 mmol/L。多酚氧化酶在pH 7.0,37℃时活性最高,并在40℃以上条件下,随着保温时间的延长酶活力下降。用槲皮苷和硫脲作抑制剂对该酶活性的抑制结果表明,这两种抑制剂分别属于竞争性和非竞争性抑制剂。     

芽胞杆菌BSD-8肌氨酸氧化酶的纯化与性质

对一株从土壤中分离到的芽胞杆菌Bacillus sp.BSD-8菌株所产生的热稳定性较高的肌氨酸氧化酶进行纯化,并对该酶的特性进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱、Toyopearl疏水层析柱和Sephadex G-75分子筛层析,使酶提纯25倍,比活力达到5.3U/mg。研究了纯化后的酶的生化特性,确定了该酶的主要特性:该酶为黄素蛋白,与黄素以非共价键的方式结合,由单一亚基组成,其亚基分子量为51kDa。酶的最适反应温度及pH分别为60℃与8.5。该酶在60℃及pH8.0~10.0条件下稳定。以Lineveaver-Burk作图法求得该酶米氏常数Km值为3.1mmol/L。Ag+、Hg2+、SDS及Tween80对该酶有强抑制作用,而Tween20和Triton X-100对酶活性无影响。该肌氨酸氧化酶在耐热性质上比以前所报道的肌氨酸氧化酶有很大的提高,在酶法肌酐测定应用中有明显的优势。     

营养胁迫诱导的油菜子叶衰老过程中IAA氧化酶和细胞分裂素氧化酶活性的变化

以离体油菜子叶为材料,研究了营养胁迫诱导的子叶衰老过程中吲哚乙酸氧化酶(IAA氧化酶)和细胞分裂素氧化酶活性的变化。在光照条件下,离体子叶在不含任何无机元素的0．8％的琼脂中培养9d后,出现明显的衰老迹象(叶绿素含量下降,丙二醛含量上升),15d时完全死亡。在营养胁迫诱导的衰老过程中,IAA氧化酶和细胞分裂素氧化酶的活性表现出相似的变化趋势,在诱导处理1d时,两种酶的活性均比处理前有明显下降,之后又随着衰老进程逐渐上升。IAA氧化酶活性在诱导处理11d时达到高峰,超出处理前30％以上;比对照高出1倍以上;而细胞分裂素氧化酶活性在诱导处理13d时达到高峰,比对照高出3倍以上,也超过了处理前的水平。衰老过程中IAA氢化酶和细朐分裂素氧化酶活性的上升可能是导致内源激素含量下降的重要原因。     

人胚肺成纤维细胞与人肺腺癌细胞共同培养时的形态学变化

本文在混合培养的基础上建立了一种新的细胞培养技术。选用人肺腺癌细胞和人胚肺成纤维细胞,将两者按一定顺序定位培养在同一容器内的盖玻片上。在两种细胞相遇后,于不同时间取出长有细胞的盖片制成光镜和电镜标本。透射电镜标本采用了经过改进的原位包埋、水平切片法,使两种不同类型的细胞之间在定位培养时的超微结构变化得到充分显示。观察结果表明：两种细胞定位培养４天时,光镜观察未见明显的形态学改变,但电镜下已显示出变化;培养７天时,光镜及电镜观察均可见到与肿瘤细胞接触的成纤维细胞有损伤,与成纤维细胞接触的肿瘤细胞胞膜亦有破损。细胞化学染色显示肿瘤细胞周围的成纤维细胞内琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）活性降低。     

耐高温重组CotA蛋白的胆红素氧化酶反应动力学及活性鉴定

已知源于枯草芽孢杆菌内生孢子的CotA蛋白具有漆酶和胆红素氧化酶活性。然而,其分离纯化极为困难。本研究对表达与纯化的重组CotA蛋白的胆红素氧化酶特性及氧化还原功能进行鉴定。基因转染及筛选获得了表达CotA的P. pastoris菌株|继而,表达的重组CotA蛋白经DEAE-Sepharose FF 及Sephadex G-75层析分离与纯化,产物得率为25%,纯化产物的酶比活性为 4 U/mg。经SDS-PAGE 和 MALDI-TOF MS 分析显示,其分子质量为65 kD。纯化的CotA蛋白能够催化胆红素氧化,生成胆绿素,且催化反应速率受反应溶液中溶解氧含量的影响,提示纯化的重组CotA具有胆红素氧化酶活性。酶反应进一步证明,CotA的胆红素氧化酶反应最适pH值为pH 8.0,最适温度为60℃。该酶在90℃条件下的半衰期为7 h,提示CotA胆红素氧化酶具有高度的热稳定性。CotA修饰的摄谱仪石墨电极可直接电催化分子氧（O2）还原,具有很好的电流响应。我们的结果表明,重组的CotA蛋白具有耐高温胆红素氧化酶活性。更重要的是,我们的结果还提示重组的CotA蛋白在酶生物燃料电池阴极的制备上具有较好的应用潜能。     

假单胞菌产生铁氧化酶条件的研究

以氧化铁锰假单胞菌FEl3-26为实验菌株,对其铁氧化酶的产酶条件进行研究,结果表明柠檬酸铁铵和硝酸钠分别是该菌产酶的最佳碳氮源.最适产酶条件为温度28～30℃.起始pH值6.5～7.5,接种量2%,150 r/min振荡培养72 h.酶的定位研究结果显示该菌产生的铁氧化酶是一种胞外酶.     

高等植物GA 20-氧化酶研究进展

GA20-氧化酶（GA 20-oxidase）是高等植物体内GA生物合成途径中最重要的限速酶,它能够催化从GA12到GA9及GA53到GA20-系列的氧化反应。作者对近年来有关GA20一氧化酶的特征,GA20一氧化酶基因及编码蛋白、GA20一氧化酶基因表达调控进行了综合评述,并对GA20一氧化酶基因转化在农业、林业、;园艺业方面的应用前景进行了展望。     

丙酮酸的酶法转化及乳酸氧化酶的研究进展*

丙酮酸是一种用途非常广泛的有机酸,酶法转化乳酸生成丙酮酸由于具有条件温和、对环境污染小、成本低、得率高的优点而成为目前最具竞争力和吸引力的丙酮酸生产方法。常规的酶转化法是通过乳酸脱氢酶催化乳酸转化为丙酮酸,但此酶需要MAD^ /NADP^ 作电子受体,NAD^ /NADP^ 价格昂贵,且不易重复使用,使乳酸脱氢酶不能广泛和大规模使用,乳酸氧化酶则克服了这一缺点,它不需要辅助因子即可催化乳酸,从而成为制备丙酮酸的理想的酶。迄今为止,人们已经找到了数种能合成乳酸氧化酶的微生物,并对该酶进行了较深入的分子生物学研究,其研究成果为将这种有价值的酶源推向生产奠定了基础。     

寡糖氧化酶研究进展

寡糖氧化酶（oligosaccharide oxidase）是一种新型氧化酶,属于辅助活性家族7（auxiliary activity family 7,AA7）。其可作用的底物范围较广,能够催化多种寡糖氧化成相应的醛酸,并在反应过程中产生过氧化氢。根据寡糖氧化酶的作用底物,可将已报道的寡糖氧化酶分为葡糖寡糖氧化酶（gluco-oligosaccharide oxidase,GOOX）、木寡糖氧化酶（xylo-oligosaccharide oxidase,XOOX）和壳寡糖氧化酶（chito-oligosaccharide oxidase,COOX）等。寡糖氧化酶用途广泛,可应用于食品、医药、饲料、生物燃料等多种领域。但目前国内外对寡糖氧化酶的研究较少。基于此,从基本酶学性质、分子结构、作用机理、酶分子改良及应用等方面对寡糖氧化酶进行了综述,以期为寡糖氧化酶的实际研究及应用提供参考。     

甾短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中的表达

为了实现胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达,将甾短杆菌Brevibacterium sp．DGCDC-82胆固醇氧化酶基因用PCR的方法去掉信号肽序列,连接到质粒pTrc99a,遗过筛选得到了表达胆固醇氧化酶的重组菌JMl09／pTrc99a—COD。经IPTG诱导后表达出相对分子质量约为5．5×10^4的蛋白质。分别考察了诱导温度、时间、IPTG浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下,该胆固醇氧化酶的酶活可以达到700U／L。酶学特性分析表明其反应的最适pH为7．5,最适温度为40℃。