与成纤维细胞共培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞的生物学特性

建立胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）与肺成纤维细胞（LF）共培养模型,观察与LF共培养下AECⅡ的生物学特性。倒置相差显微镜观察AECⅡ形态和基本生长情况：RT-PCR和流式细胞术分别检测肺泡表面活性蛋白-C（SP-C）、水通道蛋白5（AQPS）mRNA及蛋白质表达;流式细胞术检测细胞周期及Ki67表达。结果显示,与LF共培养时,AECⅡ能较好地保留其细胞形态。SP-C mRNA及其蛋白质表达明显增加,而AQP5mRNA及其蛋白质表达则明显减少;LF促进AECⅡ增殖,使G2／M、S期细胞及表达Ki67^＋细胞的比率明显增多。结果提示,AECⅡ与LF共培养时,能更好地保留其细胞形态、分化及增殖特性。     

肺泡II型上皮细胞转分化

哺乳动物肺泡上皮细胞主要由肺泡II型上皮细胞(AECII)和肺泡I型上皮细胞(AECI)组成。在肺发育和肺损伤修复过程中,AECII可转分化为AECI,体外原代培养的AECII有这种转分化的特性。现对AECII转分化的标志、影响及调控因素及其在肺损伤中的作用进行综述。     

维甲酸对高氧暴露下原代培养的胎鼠肺泡II型上皮细胞和成纤维细胞增殖与凋亡的影响

探讨高氧暴露对原代培养的胎鼠肺泡II型上皮细胞(AECII)、成纤维细胞(LFs)增殖和凋亡的影响以及维甲酸(RA)的保护作用机制。通过建立高氧暴露原代培养的胎鼠AECII和LFs模型,以RA作为干预方式,采用流式细胞术(膜联蛋白V-PI双标记)检测AECII和LFs凋亡,West-ern印迹检测AECII增殖细胞核抗原(PCNA)、p53及caspase-3表达和LFsPCNA表达。结果发现:(1)与空气对照比较,高氧暴露12h,膜联蛋白V( )PI(-)和膜联蛋白V( )PI( )标记AECII数均显著升高(14.41±1.15vs2.80±0.19,P<0.01;61.07±3.06vs1.49±0.11,P<0.01);RA对空气暴露下AECII坏死、凋亡无明显影响,但明显下调高氧暴露下膜联蛋白V( )PI(-)和膜联蛋白V( )PI( )标记AECII数(8.04±0.79vs14.41±1.15,P<0.01;27.57±2.32vs61.07±3.06,P<0.01)。(2)高氧、RA对LFs坏死、凋亡无明显影响。(3)高氧暴露12h,明显降低AECIIPCNA表达(P<0.01),显著提高其p53(P<0.01)和caspase-3活性片段(P<0.01)表达;RA显著上调高氧暴露下AECIIPCNA表达(P<0.01),下调其p53和caspase-3活化片段表达(P<0.01)。(4)高氧、RA对LFsPCNA表达无明显影响。由此提示,高氧暴露,导致AECII大量凋亡、坏死,增殖受到抑制,同时,LFs所受影响较小,两种细胞对高氧暴露的差异性行为可能是导致未成熟肺组织异常重构的重要原因;RA通过降低AECII凋亡、坏死从而对高氧肺损伤具有保护作用。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化

哺乳动物肺泡上皮细胞主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）和肺泡Ⅰ型上皮细胞（AECⅠ）组成。在肺发育和肺损伤修复过程中,AECⅡ可转分化为AECⅠ,体外原代培养的AECⅡ有这种转分化的特性。现对AECⅡ转分化的标志、影响及调控因素及其在肺损伤中的作用进行综述。     

东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞（MfEF）分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性。方法取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性。结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛。结论获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法 ,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果 0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显;DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

用于克隆的猕猴耳成纤维细胞的培养及其有关生物学特性

应用组织块培养法成功地分离培养了猕猴耳皮肤成纤维细胞。对培养细胞进行了形态观察、生长曲线测定、免疫细胞化学分析、染色体和周期分析,结果表明培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架系统和染色体数目,而且随着细胞汇合程度的增加,G0／G1期细胞所占的比例上升,70％-80％和90％-100％两种汇合程度的G0/G1期和S期比例间存在明显的差异(P<0.05)。对培养猕猴耳成纤维细胞的有关生物学特性进行分析,有利于给同种和异种体细胞克隆猴研究提供形态良好、染色体数目正常的供体细胞,同时也为体细胞转基因等其他领域的研究提供了基础条件。     

维甲酸对高氧暴露下原代培养的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞增殖与凋亡的影响

探讨高氧暴露对原代培养的胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）、成纤维细胞（LFs）增殖和凋亡的影响以及维甲酸（RA）的保护作用机制。通过建立高氧暴露原代培养的胎鼠AECⅡ和LFs模型,以RA作为干预方式,采用流式细胞术（膜联蛋白V—PI双标记）检测AECⅡ和LFs凋亡,Western印迹检测AECⅡ增殖细胞核抗原（PCNA）、p53及caspase-3表达和LFs PCNA表达。结果发现：（1）与空气对照比较,高氧暴露12h,膜联蛋白V（＋）PI（-）和膜联蛋白V（＋）PI（＋）标记AECⅡ数均显著升高（14．41±1．15 vs 2．80±0．19,P＜0．01;61．07±3．06 vs 1．49±0．11,P＜0．01）;RA对空气暴露下AECⅡ坏死、凋亡无明显影响,但明显下调高氧暴露下膜联蛋白V（＋）PI（-）和膜联蛋白V（＋）PI（＋）标记AECⅡ数（8．04±0．79 vs 14．41±1．15,P＜0．01;27．57±2．32 vs 61．07±3．06,P＜0．01）。（2）高氧、RA对LFs坏死、凋亡无明显影响。（3）高氧暴露12h,明显降低AECⅡPCNA表达（P＜0．01）,显著提高其p53（P＜0．01）和caspase-3活性片段（P＜0．01）表达;RA显著上调高氧暴露下AECⅡPCNA表达（P＜0．01）,下调其p53和caspase-3活化片段表达（P＜0．01）。（4）高氧、RA对LFs PCNA表达无明显影响。由此提示,高氧暴露,导致AECⅡ大量凋亡、坏死,增殖受到抑制,同时,LFs所受影响较小,两种细胞对高氧暴露的差异性行为可能是导致未成熟肺组织异常重构的重要原因;RA通过降低AECⅡ凋亡、坏死从而对高氧肺损伤具有保护作用。     

人成纤维细胞系HF—91的建立及生物学特性

人胚胎胰腺结缔组织经分离培养成人成纤维细胞系ＨＦ－９１,传４０代。该细胞贴壁生长,具有密度依赖性抑制性质。它的生长依赖于成纤维细胞生长因子的存在,在１０ｎｇ／１００ｎｇ／ｍｌ浓度范围内,细胞生长与ｂＦＧＦ的浓度成正相关。细胞群体倍增时间２３．８±５．３ｈ。有丝分裂指数４９．３％±４．１％染色体众数２ｎ＝４６,占８７．５％±４．１％。染色体众数２ｎ＝４６,占８７．５％－９１．０％,乳酸脱氢酮同工酶Ｌ     

脂肪干细胞与放射后成纤维细胞共培养模型的建立和lncRNA高通量测序

目的:探讨大鼠脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)对放射后成纤维细胞(fibroblast,Fb)的影响。方法:体外原代培养SD大鼠ADSCs和真皮Fb,分别对两种细胞进行鉴定,Fb辐照后两种細胞建立共培养模型。将Fb分为3组,对其进行lncRNA和mRNA转录本高通量测序。结果:ADSCs高表达CD29和CD44,低表达CD31和CD45。大鼠Fb高表达波形蛋白。Fb单纯辐照和干細胞干预后转录水平有明显的差异。结论:ADSCs能使辐射后的Fb細胞lncRNA和mRNA转录水平明显的改变,提示多项生物学功能及信号通路在其中发挥作用。     

Expression of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 and Alveolar Epithelial Cell Markers in Lungs of Human Infants with Chronic Lung Disease

The membrane protein carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule (CEACAM6) is expressed in the epithelium of various tissues, participating in innate immune defense, cell proliferation and differentiation, with overexpression in gastrointestinal tract, pancreatic and lung tumors. It is developmentally and hormonally regulated in fetal human lung, with an apparent increased production in preterm infants with respiratory failure. To further examine the expression and cell localization of CEACAM6, we performed immunohistochemical and biochemical studies in lung specimens from infants with and without chronic lung disease. CEACAM6 protein and mRNA were increased ~4-fold in lungs from infants with chronic lung disease as compared with controls. By immunostaining, CEACAM6 expression was markedly increased in the lung parenchyma of infants and children with a variety of chronic lung disorders, localizing to hyperplastic epithelial cells with a ~7-fold elevated proliferative rate by PCNA staining. Some of these cells also co-expressed membrane markers of both type I and type II cells, which is not observed in normal postnatal lung, suggesting they are transitional epithelial cells. We suggest that CEACAM6 is both a marker of lung epithelial progenitor cells and a contributor to the proliferative response after injury due to its anti-apoptotic and cell adhesive properties.     

一种原代肺上皮细胞体外培养方法

目的:建立一种操作简便、重复性好的体外培养BALB/c小鼠原代肺上皮细胞(AEC)的方法,探究不同发育阶段小鼠AEC中柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)表达量的变化,及其对小鼠原代AEC贴壁的作用。方法:手术获取小鼠肺组织,机械法剪碎肺组织,PBS缓冲液清洗肺组织块数次去血,联合使用链霉蛋白酶和胶原酶Ⅰ消化、分离肺组织块获得单细胞悬液,差速离心逐步清除其他种类的细胞,达到纯化AEC的作用。细胞在Ⅰ型鼠尾胶原蛋白包被过的细胞板中培养,光学显微镜下观察不同发育阶段AEC贴壁、生长状态;免疫荧光法鉴定AEC,检测AEC中CAR的表达量。结果:体外获得不同发育阶段BALB/c小鼠的原代AEC;胎鼠、幼鼠AEC贴壁并开始增殖所需时间较成体鼠短;胎鼠及幼鼠AEC中CAR的表达量明显较成体鼠高。结论:建立了稳定可重复的分离、纯化、体外培养小鼠原代AEC的方法,证明了AEC中的CAR可以促进原代AEC贴壁,为完善原代细胞培养方法提供了科学依据。     

The Strength of Mechanical Forces Determines the Differentiation of Alveolar Epithelial Cells

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寒冷刺激支气管上皮细胞产生外泌体促肺成纤维细胞表达气道重塑相关因子

外泌体可由多种细胞分泌,是具有多种生物学功能的细胞外囊泡,但其在气道重塑中的作用尚不明确。为探讨经寒冷刺激的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）分泌的外泌体对人胚肺成纤维细胞(HLF1)气道重塑相关因子表达的影响,收集BEAS-2B细胞株培养液提取外泌体,利用透射电镜及Western印迹对外泌体进行其大小、形态及标志性蛋白的检测;提取的外泌体与HLF1共同培育,分别设置空白对照组、正常对照组（加入未作干预的BEAS 2B细胞所产的外泌体）及寒冷刺激组（加入经寒冷刺激后的BEAS-2B细胞所产的外泌体）。运用Real-time-PCR及Western印迹技术,分别检测各组HLF1表达FGF-2、TNF-α、MMP-9的mRNA及蛋白情况。结果显示,提取BEAS-2B细胞分泌的外泌体为直径小于100 nm的圆形或椭圆形结构,并表达外泌体标志性蛋白CD9、TSG101、ALIX;寒冷刺激组24 h后,其FGF-2、TNF-α、MMP-9的mRNA及蛋白表达均显著高于空白对照组及正常对照组（均P<0.05）。本研究结果表明,BEAS-2B细胞能够释放外泌体;经寒冷刺激后的BEAS 2B细胞所释放的外泌体可以携带并传递生物信号,诱导HLF1表达气道重塑相关因子。     

Distinct Airway Epithelial Stem Cells Hide among Club Cells but Mobilize to Promote Alveolar Regeneration

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Dlk1-Mediated Temporal Regulation of Notch Signaling Is Required for Differentiation of Alveolar Type II to Type I Cells during Repair

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牛乳腺上皮细胞的分离培养及其生物学特性

采用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法分离、培养和纯化牛乳腺上皮细胞。形态学观察表明,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;染色体分析结果表明,培养的细胞具有正常的染色体数目。通过荧光免疫细胞染色方法鉴定了培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白5和8。该细胞在添加胰岛素、氢化可的松以及羊催乳素的无血清培养液中诱导培养时,用RT-PCR方法检测到了β-酪蛋白基因的转录。这些结果表明,分离培养的细胞是乳腺上皮细胞,这些细胞在诱导培养的条件下能够转录表达β-酪蛋白。