The Effects of Co-Culture of Embryonic Stem Cells with Neural Stem Cells on Differentiation

Researching the technology for in vitro differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into neural lineages is very important in developmental biology, regenerative medicine, and cell therapy. Thus, studies on in vitro differentiation of ESCs into neural lineages by co-culture are expected to improve our understanding of this process. A co-culture system has long been used to study interactions between cell populations, improve culture efficiency, and establish synthetic interactions between populations. In this study, we investigated the effect of a co-culture of ESCs with neural stem cells (NSCs) in two-dimensional (2D) or three-dimensional (3D) culture conditions. Furthermore, we examined the effect of an NSC-derived conditioned medium (CM) on ESC differentiation. OG2-ESCs lost the specific morphology of colonies and Oct4-GFP when co-cultured with NSC. Additionally, real-time PCR analysis showed that ESCs co-cultured with NSCs expressed higher levels of ectoderm markers Pax6 and Sox1 under both co-culture conditions. However, the differentiation efficiency of CM was lower than that of the non-conditioned medium. Collectively, our results show that co-culture with NSCs promotes the differentiation of ESCs into the ectoderm.     

胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的分子调控机制

胚胎干细胞在不同的诱导条件下具有多向分化的潜能,多种胞内外信号途径参与其分化过程的调控。现就胚胎干细胞向血管内皮细胞分化的诱导条件及分子机制做一综述,并阐明不同阶段的内皮前体细胞所表达的不同分子标志,同时提出胚胎干细胞在再生医学中的应用前景。     

Monitoring the Differentiation and Migration Patterns of Neural Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Using a Microfluidic Culture System

Microfluidics can provide unique experimental tools to visualize the development of neural structures within a microscale device, which is followed by guidance of neurite growth in the axonal isolation compartment. We utilized microfluidics technology to monitor the differentiation and migration of neural cells derived from human embryonic stem cells (hESCs). We co-cultured hESCs with PA6 stromal cells, and isolated neural rosette-like structures, which subsequently formed neurospheres in suspension culture. Tuj1-positive neural cells, but not nestin-positive neural precursor cells (NPCs), were able to enter the microfluidics grooves (microchannels), suggesting that neural cell-migratory capacity was dependent upon neuronal differentiation stage. We also showed that bundles of axons formed and extended into the microchannels. Taken together, these results demonstrated that microfluidics technology can provide useful tools to study neurite outgrowth and axon guidance of neural cells, which are derived from human embryonic stem cells.     

人胚胎干细胞向神经上皮祖细胞的诱导分化

人胚胎干细胞具有自我更新和多向分化潜能,是研究早期胚胎发育和细胞替代治疗的重要细胞来源.采用一种与小鼠成纤维细胞共培养的方法进行人胚胎干细胞的神经诱导,可产生高纯度的神经上皮祖细胞,其神经上皮特异性基因的表达有一定的时空性;诱导生成的神经上皮祖细胞具有增殖潜能并可分化为神经元和星型胶质细胞,是潜在的神经干细胞.人胚胎干细胞来源的神经上皮祖细胞为研究神经发育和神经诱导提供了新材料,也为神经系统疾病的细胞替代治疗提供了新的细胞来源.     

胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展

目前 ,细胞移植作为终末期肝病的辅助治疗方法 ,移植的细胞必须满足在受体肝脏中存活、增殖并可分化为成熟肝细胞两个重要条件 ,但目前应用的肝细胞来源有限 ,其功能随着培养时间的延长而逐渐下降等问题限制了这一治疗策略的广泛开展。作为具有发育全能性和无限增殖能力的细胞 ,胚胎干细胞向肝细胞的分化研究近年来引起了广泛的关注 ,并取得了较大的进展 ,寻找合适、高效的分化诱导方法是目前研究的热点之一。胚胎干细胞向肝细胞的分化研究既可以为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源 ,也可以在药物评估和肝脏发育分化基础研究方面起到重要的作用。通过概括肝脏和拟胚体分化发育的分子机制 ,对体外胚胎干细胞向肝细胞分化的几种诱导体系作了介绍 ,并对分化肝细胞的应用前景和存在的问题进行了讨论。     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

食蟹猴胚胎干细胞向间充质前体细胞诱导分化及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以诱导分化成脂肪、软骨、骨骼和骨骼肌细胞,并可作为骨骼、软骨或肌肉移植中的再生干细胞,广泛应用于细胞治疗和组织工程。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有体外培养无限增殖和多向分化的特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。该研究通过无血清条件下诱导食蟹猴ESCs形成类胚体(embryoid bodies,EBs),然后在血清条件下贴壁分化EBs成间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells,MPCs),再经过长期体外培养,纯化和扩增MPCs。结果显示,纯化后的MPCs具有MSCs生物学特征,并能在体外诱导分化成脂肪细胞和骨细胞。将这些细胞皮下注射给SCID小鼠,并未发现形成肿瘤,提示食蟹猴ESCs来源的MPCs具有一定的安全性。     

猕猴胚胎干细胞的诱导分化和凋亡

采用单层培养法研究维生素A酸(RA)、神经生长因子(NGF)、上皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)对猕猴胚胎干细胞系R366．4的诱导分化和凋亡的作用。结果表明：①不添加任何生长因子的条件下,细胞分化不定向,各种细胞所占的比例表现出明显的随机性;②添加单一生长因子能促进细胞的分化进程,并使某一类或某几类的分化细胞比例上升,RA和NGF均能促进神经样细胞的形成,EGF促进内皮样细胞的形成,bFGF提高成纤维样细胞的比例;③在分化的过程中伴有细胞早期和晚期凋亡的发生,RA和NGF可增加细胞凋亡的数量。这种由生长因子诱导的动物胚胎干细胞的分化可能存在种间差异。     

胚胎干细胞的生物学特性及体外诱导分化

来源于早期胚胎的胚胎干细胞 (ES)和胎儿生殖脊干细胞 (EG)可在未分化状态下长期增殖培养 ,并保持其多向分化潜能 .体外培养ES细胞的条件已趋于稳定 ,国内外建立了来自人和多种动物早期胚胎的ES细胞系 .某些细胞因子和化学物质等可定向诱导ES细胞分化为各种不同类型的组织细胞 .ES细胞在胚胎发育、细胞分化、转基因动物、移植治疗、药物开发等领域具有广阔的应用前景 .     

L-型钙通道对大鼠胚胎海马神经干细胞增殖和分化的调控

为鉴定大鼠胚胎海马神经干细胞(NSCs)是否表达功能性的L-型钙通道,L-型钙通道是否参与了对大鼠胚胎NSCs增殖和分化调控.分离孕15天Wistar大鼠胚胎海马组织,制成单细胞悬液,利用无血清培养技术,在添加bFGF、EGF、N-2和B27 supplement的DMEM/F12培养液中进行培养.采用细胞免疫荧光法对原代至第5代细胞进行鉴定,均有巢蛋白(nestin)的表达,第3代nestin阳性细胞比例达97%.把培养的细胞诱导分化5天后,这些细胞表现为神经元和星形胶质细胞的形态,且分别呈Ⅲ型β-微管蛋白(Tuj1)阳性和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性;细胞免疫印迹结果显示,NSCs表达L-型钙通道的Cav1.2α1C亚单位,而无Cav1.3α1D亚单位的表达;利用全细胞膜片钳技术在NSCs上记录到了L-型钙电流,证明了NSCs所表达的L-型钙通道具有功能.进一步对细胞进行药理学干预,发现L-型钙通道的激活不仅可以促进胚胎NSCs的增殖,而且使增殖的NSCs向神经元分化的比例显著增加.以上结果表明,Wistar大鼠胚胎海马NSCs表达功能性的L-型钙通道;L-型钙通道参与了胚胎NSCs增殖和分化的调控.     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．     

诱导胚胎干细胞向神经细胞分化方法的研究与探讨

胚胎干细胞(ES细胞)是一种能够在体外进行不断自我更新,并具有多种分化潜能的细胞。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展迅速,相关实验技术和理论也不断发展。总结了近年来各国研究者诱导小鼠和人胚胎干细胞向神经细胞分化的方法,分析了一些方法的原理并初步探讨其相关的分子机制,并提出一些可行性新方法。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化因其体外的可操作性、来源的广泛性及质量可控性将有可能成为临床上治疗神经系统疾病的有效方法。     

小鼠胚胎干细胞分化形成拟胚体过程中的细胞程序性死亡

为了检测小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell ,ES细胞 )体外分化的拟胚体 (embryoidbodies ,EBs)形成过程中细胞程序性死亡 (programmedcelldeath ,PCD)的发生 ,通过悬滴、悬浮培养技术定向诱导未分化的ES细胞分化为拟胚体 ,并用RT PCR检测原始内胚层、原始外胚层、中胚层、内脏内胚层 4种分子标记物在EBs中的表达 .通过TUNEL染色、电镜、激光共聚焦显微镜及Western印迹以确定凋亡发生 .结果表明 :ES细胞体外分化为拟胚体并且表达各胚层相应的分子标记物 ;在拟胚体的发育过程中出现明显的空腔化过程 ,TUNEL染色及电镜观察到凋亡生成 ,同时线粒体膜电位 (ΔΨm)在拟胚体发育过程中降低 ,通过Western印迹检测到caspase3、caspase8的激活 .表明小鼠ES细胞所分化的拟胚体可以作为研究早期胚胎发育的实验模型 ,线粒体在拟胚体的细胞程序性死亡过程中发挥重要的作用 .为进一步利用拟胚体研究细胞程序性死亡及相关信号分子在小鼠胚胎发育早期的作用奠定了基础     

抑制MTM1表达促进胚胎干细胞分化

应用随机RNAi文库,筛选了与胚胎干细胞自我更新和分化调控相关基因,发现了多个阳性候选基因,对其中的1个阳性候选基因肌管素1（myotubularin, MTM1）基因进行了深入研究．MTM1是属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPase）蛋白家族的蛋白,其基因突变导致肌管性肌病．MTM1在胚胎干细胞中的功能到目前为止还不清楚．研究证实,MTM1在小鼠胚胎干细胞系CCE和R1均有表达．应用RNA干扰及集落形成实验证明,MTM1表达抑制后,处于自我更新状况胚胎干细胞集落的比例显著增加,提示MTM1在胚胎干细胞自我更新和分化的调控中起了重要的作用．     

胚胎干细胞向肝细胞诱导分化

胚胎干细胞具有分化成三胚层细胞的潜能。它已被视为治疗多种疾痛的一种新兴策略。在现阶段,通过不同的诱导途径可将胚胎干细胞诱导成为肝细胞：体外诱导、体内诱导以及体外和体内相结合诱导分化。然而从体内实验结果来看,其嵌合率及分化率不高,这是一个亟需解决的问题,否则就无法成功地将其应用于临床治疗。     

人胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞

采用单层贴壁分化的方法在无血清条件下诱导同源饲养层培养的人胚胎干细胞定向分化,得到了高比例的神经前体细胞(97.5±0.83)%(P<0.05)。这些神经前体细胞具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。在长期的传代培养中发现,随着培养时间的延长,nestin阳性的神经前体细胞比例下降,同时发育能力也发生了变化。在传代培养的早期,神经前体细胞发育为神经元的比例很高,几乎没有胶质细胞分化出来。随着培养时间的延长,胶质细胞的比例逐渐上升。这与体内神经系统的发育过程非常相似。进一步研究发现具有bHLH(basic helix-loop-helix)结构域的转录因子neurogenein2(Ngn2)和Olig2可能在这一变化中起重要作用。因此,人胚胎干细胞来源的神经前体细胞能够模拟体内神经发育的模式,为在体外研究人的神经发育和再生医学奠定了基础。     

人类胚胎干细胞系H9培养和分化中细胞异质性的发现

目的:在人类胚胎干细胞系H9培养和分化过程中探讨该细胞系的异质性。方法:对人类胚胎干细胞系H9进行体外未分化培养和诱导分化,鉴定其多潜能性和分化状态;在诱导其向拟胚体细胞的分化过程中,检测多潜能相关基因及分化特异基因的表达情况。结果:发现多潜能相关基因(Oct4、SOX2和Nanog)和种系特异性基因(Cdx2、Bachurary、SOX1、Fgf5和AFP)并不限于分别在未分化细胞和分化细胞中表达。结论:提示H9细胞系在培养过程中的非基因异质性现象,为进一步认识胚胎干细胞的自我更新和多潜能性提供了有意义的参考。     

体外分步诱导猕猴胚胎干细胞为肝细胞

采用分阶段诱导方法模拟肝细胞体内发育,建立体外诱导猕猴胚胎干细胞（rhesus monkey embryonic stem cells, rESCs）分化为成熟肝细胞的体系,对研究以ES细胞为基础的临床替代治疗人类晚期肝脏疾病具有重要的意义。将rESCs团块在含有10% FBS的DMEM培养基中悬浮培养11d,形成含有早期内胚层细胞的拟胚体（embryonic bodies, EB）并开始表达早期肝细胞的部分基因或蛋白,将11日龄EB接种至包被有ECM的组织培养皿,分阶段加入aFGF、BMP-4及OSM。经aFGF和BMP-4诱导7～10d后,分化细胞形态变为具有双核的多角形细胞,表达早期和中期肝细胞特异性的蛋白（AFP、ALB及CK18）和基因（AFP、ALB、APOH,G-6-P及TAT）,并具有储存糖原的功能。撤除aFGF和BMP-4,添加OSM继续诱导7～10 d,分化的细胞表达成熟肝细胞所特有基因CYP1B1和ADH1C,并具有摄取靛青绿的能力。