植物生物反应器研究进展

利用植物生物反应器生产外源蛋白具有许多优点 ,其吸引力与日俱增。转基因植物生物反应器已逐步成为国内外基因工程领域的研究热点之一。就其概念、特点和研究进展、存在的问题等作一综述。     

植物生物反应器的研究进展

利用植物生物反应器生产外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统,以下介绍了植物生物反应器的不同表达系统,及其各个系统的发展进程和研究现状等。重点论述了应用植物各大表达系统生产疫苗、抗体和医用蛋白等方面的情况以及本实验室在这一领域的研究情况。随着该领域研究的进展,植物生物反应器用于生产低成本药用蛋白的产业化将显示出越来越良好的发展前景。     

乳腺生物反应器及基因药物tPA的研制与开发

生物医药产业经历了天然药物 (如中草药 )、化学方法合成新的药物 (如西药 )和基因药物这三个发展阶段 .基因药物也经历了细菌基因工程、细胞基因工程和乳腺生物反应器 (即利用转基因动物乳腺来生产基因药物 )这三个发展阶段 .目前 ,国内外主要是采用前两种方法 (微生物发酵法、哺乳动物细胞培养法 )来生产基因药物 ,其产品有胰岛素、白细胞介素、干扰素、凝血因子、EPO(促肾红细胞生长素 )等 .虽然在细菌和酵母中生产基因药物周期短 ,且相对便宜 ,但产品质量往往达不到要求 ;动物细胞培养方法生产基因药物 ,质量很好 ,但生产成本很高 ,价…     

以油体作为生物反应器的研究进展

获得安全、经济、稳定具有生物活性的重组蛋白,应用于基础研究及临床应用是一个重大的战略课题,现在可以利用酵母、细菌和动物细胞生产多种药物蛋白,但这些蛋白的生产过程还存在许多问题.利用植物作为生物反应器生产药用蛋白和疫苗是目前生物反应器研究的热点.油体蛋白在油料作物种子中高水平表达且易于分离,经过改造后是生产目的蛋白的一种理想栽体.介绍了油体、油体蛋白的结构以及利用植物油体蛋白表达体系这一新型植物生物反应器生产目的蛋白的研究进展和前景.     

外源蛋白表达系统及利用植物表达外源蛋白的特点与优势

比较了大肠杆菌,酵母,昆虫细胞/杆状病毒,哺乳动物细胞,动物乳腺以及植物等不同受体作为外源蛋白表达系统的优缺点。论述了植物外源蛋白表达系统的特点,阐述利用植物生产外源蛋白的潜在优势。     

植物生物反应器在分子医药农业中的应用

植物生物反应器作为分子医药农业的核心内容,与动物反应器和微生物反应器相比具有操作简便、成本低、规模化、周期短等优势,越来越多地被人们认识和应用。阐述了植物生物反应器转化载体构建和基因优化的方法、常用的植物受体种类,以及植物表达系统类型三个方面的研究进展。随着药用蛋白需求量的大幅度增加,植物生物反应器以其低成本的优势将显示出广阔的应用前景。     

植物生物反应器生产药物蛋白的前景

转基因植物作为生物反应器生产重要的药用蛋白,如抗体、血液替代品和疫苗,为健康保健和科学研究提供充足的生物药物,满足人们日益增长的需要。本文综述了这一领域的研究进展以及商业化前景。     

植物生物反应器优化策略与最新应用*

随着分子生物学和植物基因工程的迅猛发展以及分子医药和现代农业等学科的交叉融合,植物生物反应器已成为分子医药农业的核心内容。利用植物生物反应器生产抗体、疫苗和功能性食品,具有规模化、成本低、安全性高、周期短等优势。2022年2月,加拿大卫生部批准了新型冠状病毒疫苗Covifenz^®,这是世界首款植物源人体疫苗,标志着以植物生物反应器为代表的分子医药农业时代的来临。综述植物叶片和种子等代表性的植物生物反应器类型,分析瞬时表达系统和稳定表达系统的构建原理和应用,探讨通过启动子和密码子优化、糖基化过程“人源化”、基因沉默抑制和蛋白酶作用抑制等优化植物生物反应器的策略,总结国内外抗体、疫苗和功能性食品等植物源产品的开发进展,以期为我国植物生物反应器的研究及其在分子医药领域的应用提供参考。     

乳腺生物反应器的研究现状和产业化前景

转基因动物乳腺生物反应器是伴随转基因动物技术而发展起来的一项高新生物技术。利用这项技术,我们可以从动物乳汁中源源不断地获取用于医疗或保健目的的有生物活性的基因产物。这是一种全新的蛋白质生产模式,它将成为许多国家的重要支柱产业之一。本文介绍了乳腺生物反应器的基本概念和基本原理;概述了制备过程中的目的基因选择、载体构建、转基因等技术环节的研究现状;分析了乳腺生物反应器的优势及存在的问题,并就其产业化前景进行了展望。     

动物乳腺生物反应器的研发及应用

简要介绍了动物乳腺生物反应器的制备技术、产品优势以及研发现状等,并指出存在的问题及前景。     

家蚕核型多角体病毒基因polh的诱变分析

曾报道经化学诱变剂ＭＭＣ、９－ＡＡ和ＥＭＳ诱变的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体形态出现异常,继代分离的诱变ＢｍＮＰＶ基因组对ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ和ＢａｍＨＩ的酶切谱发生变化。研究进一步揭示,诱变ＢｍＮＰＶ的多角体外层蛋白晶格排列呈现紊乱;多角体蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳谱与对照组比较有显著差异;对多角体蛋白基因ｐｏｌｈ的测序结果显示,３组诱变ＢｍＮＰＶ的ｐｏｌｈ基因发生了多处碱基（氨基酸     

家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子功能区域缺失分析

杆状病毒DNA解旋酶是病毒复制所必需的。瞬时表达分析显示 ,家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子属于延迟早期基因启动子。通过PCR技术在该启动子区产生的一系列缺失分析表明 ,解旋酶基因启动子的基础转录调控区主要位于ATG上游 - 5 1 0～ - 4 1 0bp之间。当只保留ATG上游 98bp区段时 ,仍可测到该启动子的基础活性。在病毒因子存在下 ,将启动子区域删除到ATG上游 - 4 1 0bp时 ,对启动子活性影响不大 ;若继续删除 ,则其活性显著下降。据此推测对病毒因子响应的启动子区段应主要位于ATG上游 - 4 1 0～ - 30 9bp之间     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

采用PCR方法克隆了家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJstrain)的酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因(ptp) ,测定了该基因的核苷酸序列 ,比较了与相关病毒相应基因的同源性 ,并将该基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,编码 16 8个氨基酸残基的蛋白多肽 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酶酯催化部位的“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV) ptp 基因和BmN PV -T3 株 (日本 )拟为的 ptp基因核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 % ,蛋白质氨基酸序列的同源性分别为 97 0 %和 97 6 %。将该基因插入到温度诱导型表达质粒pBV2 2 1的温控启动子PRPL 之后 ,在大肠杆菌JM10 9中表达了具有催化活性的蛋白质 ,分子量约为 19kD ,表达产物能催化对硝基酚磷酸钠 (PNPP)的脱磷酸反应 ,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCl2 抑制     

家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子及增强子hr3功能分析

从BmNPVZJ8株克隆了解旋酶（helicase)基因ATG上游的510bp启动子,序列分析发现,该启动子同时具有早期和晚期RNA转录起始位点,将起始密码突变为ATT后,引入萤火虫荧光素酶（Luc)基因作瞬时表达分析,用表达质粒pBmhel510luc转染Bm-5和Sf-21细胞,解旋酶基因启动子能被细胞的RNA聚合酶识别,具有早期启动子的特性,且病毒因子对hel510启动子具有反式激活作用。杆状病毒同源重复区（hr)序列是病毒DNA复制起始点,又具有增强子功能,将BmNPVhr3序列克隆到hel510启动子的下游进行瞬时表达,结果表明,hr3可增强hel510启动子在昆虫细胞和家蚕幼虫中的转录活性分别在7000倍和1000倍左右。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

人促红细胞生成素基因在家蚕体中的高效表达

人促红细胞生成素(EPO)是一种调控红系干细胞增殖、分化和成熟的糖蛋白激素。将合成的EPO cDNA插入杆状病毒转移载体pBlueBacⅢ,使其置于Ph基因强启动子控制之下,获得了转移载体pBlueBacEPO。将pBlueBacEPO DNA与野生型BmNPV DNA共转染BmN细胞,经空斑纯化,获插入EPO cDNA的重组病毒rBmNPVEPO。经Sonthern杂交和PCR扩增鉴定证明人EPO基因已正确组建于BmNPV的预定位置。将重组病毒rBmNPVEPO穿刺接种5龄幼虫和蛹,收集感染第3～5d的幼虫血淋巴和3～6.5d蛹血淋巴。用ELISA检测幼虫血淋巴中EPO表达量高达62800u/mL,蛹血淋巴中表达量达74000u/mL。Western blot结果显示幼虫血淋巴和蛹血淋巴均有一条明显的免疫杂交带,分子量均约为26kD。用TF1细胞对幼虫表达产物进行了生物活性测定,每毫升血淋巴中EPO活性约为63000u。     

应用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测家蚕核型多角体病毒的研究

由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoyhedrosis virus,BmNPV)侵染家蚕Bombyx mori引起的家蚕核型多角体病(血液型脓病)在养蚕生产中发生较为普遍,对蚕业生产造成重大的经济损失。本研究建立了快捷有效的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)用于快速检测BmNPV,为蚕业生产提供了一个有效检测BmNPV和进行早期诊断的技术。该方法是针对BmNPV的pe38基因的6个区段设计的6条引物用于扩增检测,整个反应在恒温条件63℃下进行25 min,扩增产物用电泳法和可视法检测(用SYBR Green I染色)。结果显示,LAMP检测方法的灵敏度是常规PCR方法的100倍,能检测的范围为21个拷贝。另外,用4.86×108OBs/mL感染4龄起蚕,提取血淋巴DNA为模板,PCR在感染36 h后检出病毒DNA,LAMP法能检测感染12h后的样品。     

家蚕质多角体病毒(BmCPV)基因组dsRNA片段V的全序列测定

质多角体病毒属于呼肠孤病毒科质多角体病毒属,代表种为家蚕质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV).质多角体病毒粒子为正二十面体,直径约60nm～80nm,正二十面体的十二个顶点均有管状突起.     

家蚕核型多角体病毒山东株p35基因的克隆及序列分析

根据家蚕核型多角体病毒T3株p35基因非编码区序列设计一对特异性引物,应用PCR技术从家蚕核型多角体病毒山东株中扩增得到一条1 080 bp的片段。测序结果表明,该片段含有p35基因,开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,分子量为34.91kDa,pI=6.4。序列分析表明,BmNPV山东株的p35基因与T3株存在差异。 Abstract:According to the 5′ and 3′ untranslated region sequences of p35 gene from Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus isolate T3,a pair of primers was designed employing computer analysis.With the primers,polymerase chain reaction (PCR) was performed and a 1 080 bp fragment was obtained from BmNPV strain Shandong.Sequencing result showed that it was p35 gene (GenBank accession number：AY157746),and it included an open reading frame of 900 bp,encoding 299 amino acids with Mr=34.91kDa and pI=6.40.BLAST analysis indicated that there were seven bases and three amino acids difference between p35 from BmNPV strain Shandong and that from BmNPV isolate T3.     

家蚕CyPA基因的克隆、表达谱及进化分析

CyP蛋白家族在蛋白质折叠过程中起着重要作用。本研究克隆了家蚕Bombyx mori CyPA基因(BmCyPA),该基因由2个外显子和1个内含子组成,推导开放阅读框编码165个氨基酸,分子量为19.4 kD,等电点为8.79。序列分析表明BmCyPA在不同物种间具有高度的保守性,含有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性位点及与CsA侧链结合的氨基酸,提示BmCyPA可能具有肽酰脯氨酸顺反异构酶活性和与CsA结合的特性。组织表达谱及EST数据分析显示,BmCyPA在丝腺中高丰度表达。通过对不同物种来源的CyP基因的进化分析,进一步预测了BmCyP基因的功能,BmCyP可能与丝蛋白的正确折叠相关。